【摘要】：研究背景:微生物感染是孕婦常見疾病,嚴(yán)重患者可導(dǎo)致孕婦并發(fā)癥和有害胎兒出生結(jié)局。微生物感染引起的發(fā)育毒性已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注,課題組使用細(xì)菌脂多糖(LPS)成功建立了小鼠孕期感染模型,系列研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕期LPS暴露引起流產(chǎn)、胚胎和胎兒死亡、畸形、宮內(nèi)生長受限、早產(chǎn)、出生后神經(jīng)發(fā)育受損和代謝異常。過去的研究更多的關(guān)注LPS對(duì)子代的發(fā)育毒性及其機(jī)制,但對(duì)母體的損害效應(yīng)關(guān)注較少。膽汁酸代謝紊亂是妊娠期常見的疾病,不僅可以導(dǎo)致子代不良妊娠結(jié)局,還誘發(fā)孕婦死亡和妊娠并發(fā)癥,增加孕婦產(chǎn)后肝臟疾病和代謝改變的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)LPS可以干擾成年小鼠膽汁酸的代謝過程,提示孕期LPS可能誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂。膽汁酸按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸兩類,不同的膽汁酸成分由于疏水性和親水性不同對(duì)組織和細(xì)胞的毒性存在較大差異。因而,確定孕期LPS對(duì)孕期膽汁酸譜的影響具有重要的意義。膽汁酸可以作為信號(hào)分子激活法尼醇X受體(FXR)參與對(duì)糖、脂、氨基酸、能量、內(nèi)分泌和炎癥的調(diào)控,引起了越來越廣泛的關(guān)注。膽汁酸受體FXR在調(diào)控膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。肝臟細(xì)胞緊密連接也在膽汁酸紊亂形成過程中發(fā)揮重要作用。機(jī)體內(nèi)的膽汁酸穩(wěn)態(tài)還受生物節(jié)律調(diào)控,生物節(jié)律紊亂能誘發(fā)膽汁淤積,而炎癥也能干擾肝臟生物節(jié)律基因表達(dá)和肝臟代謝穩(wěn)態(tài)。此外,LPS能誘發(fā)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過下調(diào)膽汁酸合成酶Cyp7a1抑制膽汁酸合成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器需肌醇酶1α(IRE1α)可通過自身磷酸化激活其核酸內(nèi)切酶活性剪切含有特異性堿基序列的mRNA和mi RNA,在代謝和肝臟疾病中發(fā)揮作用。研究還發(fā)現(xiàn)FXR激動(dòng)劑奧貝膽酸(OCA)通過激活I(lǐng)RE1信號(hào)減輕肝損傷。因此,FXR在孕期LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂過程中的作用機(jī)理需要深入研究,肝臟生物節(jié)律基因是否參與FXR對(duì)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂的調(diào)控過程,以及IRE1α核酸內(nèi)切酶在FXR影響LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂中的作用也需要被進(jìn)一步研究。目的:本課題擬通過觀察急性LPS暴露對(duì)孕期母體膽汁酸譜的影響,確定LPS對(duì)母體膽汁酸代謝的干擾作用,通過觀察FXR激動(dòng)劑OCA對(duì)LPS誘發(fā)母體膽汁酸代謝紊亂的影響,確定OCA對(duì)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂的保護(hù)作用;探討OCA激活FXR信號(hào)在孕期LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂過程中的作用機(jī)理;初步探討肝臟生物節(jié)律基因與OCA保護(hù)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂之間的關(guān)聯(lián);通過分析OCA對(duì)LPS激活母鼠肝臟組織IRE1信號(hào)的影響,結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)觀察IRE1α核酸內(nèi)切酶選擇性抑制對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑下調(diào)肝細(xì)胞膽汁酸合成關(guān)鍵酶Cyp7a1的影響,初步探討IRE1α核酸內(nèi)切酶在OCA保護(hù)LPS誘發(fā)膽汁酸紊亂中的作用。方法:本研究包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):為觀察急性LPS暴露對(duì)孕期母體膽汁酸譜的影響,將受孕ICR小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和LPS暴露組。在GD17上午9:00 AM經(jīng)腹腔注射給予LPS暴露組孕鼠200μg/kg LPS單次處理,對(duì)照組孕鼠給予等容積的生理鹽水。為觀察FXR激動(dòng)劑OCA在LPS誘發(fā)孕期膽汁酸代謝紊亂中的作用,將受孕ICR小鼠隨機(jī)分成6組。LPS 0h、1h和6h暴露組孕鼠在GD17分別經(jīng)腹腔注射給予單劑量LPS(200μg/kg)處理,OCA干預(yù)組孕鼠在GD15-17每日早晨8:00AM經(jīng)灌胃給予OCA(5 mg/kg)預(yù)處理,再給予單劑量LPS處理。所有小鼠均在GD17上午9:00AM開始禁食,6 h后于15:00 PM處死,收集母鼠血液和肝臟組織。體外實(shí)驗(yàn):(1)為驗(yàn)證OCA對(duì)LPS抑制FXR信號(hào)的激活作用,將AML12細(xì)胞共分為6組,LPS 0 h處理組、LPS 1 h處理組、LPS 6 h處理組、OCA+LPS 0 h處理組、OCA+LPS 1 h處理組和OCA+LPS 6 h處理組,用2μg/ml LPS處理AML12肝細(xì)胞,用10μM OCA在LPS處理前1 h預(yù)處理AML12肝細(xì)胞。所有AML12肝細(xì)胞均在同一時(shí)間收集。(2)為研究IRE1α核酸內(nèi)切酶對(duì)膽汁酸合成限速酶Cyp7a1的影響,使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(TM)激活I(lǐng)RE1α核酸內(nèi)切酶,用IRE1α核酸內(nèi)切酶特異性抑制劑STF-083010(STF)預(yù)處理抑制IRE1α核酸內(nèi)切酶的激活,觀察對(duì)Cyp7a1 mRNA的影響。AML12肝細(xì)胞處理共分為4組:對(duì)照組、單純STF預(yù)處理組、TM處理組和STF+TM共處理組。用1.5μg/ml TM處理AML12肝細(xì)胞,用60μM STF在LPS處理AML12肝細(xì)胞前1 h進(jìn)行預(yù)處理,所有AML12肝細(xì)胞均在LPS處理后6h同一時(shí)間進(jìn)行收集。用全自動(dòng)生化分析儀以生化比色法分別測(cè)定血清總膽汁酸(TBA);用LC-MS/MS檢測(cè)母鼠血清和肝臟組織膽汁酸譜;用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)FXR核蛋白水平、CYP7A1和CYP3A總蛋白水平,以及總蛋白p IRE1α/IRE1α水平,用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)母鼠肝臟組織Fxr、Shp、Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp3a11、Bsep、Bcrp、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mdr1a、Mdr1b、Mdr3、Bmal1、Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Rev-erbα、Rorα、Dbp、Tjp1、Tjp2、E-cadherin、Occludin和Xbp-1s等基因mRNA水平。結(jié)果:(1)本課題通過觀察急性LPS孕晚期處理ICR小鼠對(duì)母體膽汁酸代謝和膽汁酸譜的影響,發(fā)現(xiàn)孕晚期母鼠LPS暴露能誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂,明顯升高母鼠血清CA、TCA、DCA、CDCA、GCA、TCDCA、TUDCA和GCA以及肝臟組織DCA和CA等膽汁酸成分的含量,改變了母鼠血清和肝臟組織膽汁酸譜。(2)本課題通過觀察FXR激動(dòng)劑OCA預(yù)處理對(duì)LPS孕誘發(fā)母體膽汁酸代謝紊亂的影響,發(fā)現(xiàn)OCA預(yù)處理明顯降低母鼠血清CA、TCA、DCA、TCDCA、CDCA、GCA和TDCA以及肝臟組織DCA、TCA、TDCA、TUDCA、CDCA和TCDCA等膽汁酸成分的含量,保護(hù)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂。(3)本課題通過觀察FXR激動(dòng)劑OCA對(duì)急性LPS孕晚期處理ICR小鼠對(duì)母體肝臟組織膽汁酸代謝過程的影響,發(fā)現(xiàn)孕晚期母鼠LPS暴露下調(diào)膽汁酸分解酶CYP3A1和膽汁酸合成限速酶CYP7A1和CYP8B1,明顯降低母鼠肝臟組織Bsep、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mdr1a和Mdr3等轉(zhuǎn)運(yùn)體和Tjp1、E-cadherin和Occludin等緊密連接結(jié)構(gòu)關(guān)鍵基因的mRNA水平;OCA預(yù)處理能明顯下調(diào)CYP7A1,并上調(diào)CYP3A和轉(zhuǎn)運(yùn)體Mdr1a、Mdr1b mRNA水平,表明孕期LPS暴露通過下調(diào)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和緊密連接關(guān)鍵基因誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂,OCA可以通過激活FXR降低膽汁酸合成、增加膽汁酸分解和增強(qiáng)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂起保護(hù)作用。(4)本課題通過觀察FXR激動(dòng)劑OCA對(duì)LPS處理孕晚期ICR小鼠對(duì)母體肝臟生物節(jié)律基因的影響,發(fā)現(xiàn)LPS明顯升高母鼠肝臟生物節(jié)律正調(diào)控因子Bmal1的mRNA水平,降低生物節(jié)律負(fù)調(diào)控因子白蛋白D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(Dbp)、Per2和Rev-erbα的mRNA水平,以負(fù)調(diào)控因子DBP的降低最顯著,并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,OCA預(yù)處理進(jìn)一步明顯升高母鼠肝臟Bmal1的mRNA水平,也進(jìn)一步明顯降低Dbp、Per1和Per2的mRNA水平,也以DBP mRNA水平的降低最顯著,表明LPS干擾孕晚期母體膽汁酸代謝,以及OCA保護(hù)LPS暴露對(duì)膽汁酸代謝的干擾作用,均與受生物節(jié)律調(diào)控的基因DBP相關(guān)。(5)本研究通過分析FXR激活對(duì)LPS暴露激活母鼠肝臟組織IRE1α-XBP1信號(hào)的影響,結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)觀察IRE1α核酸內(nèi)切酶選擇性抑制劑STF-083010對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素激活肝細(xì)胞IRE1α-XBP1信號(hào)和下調(diào)膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1的影響,發(fā)現(xiàn)孕晚期LPS暴露能激活母鼠肝臟組織IRE1α-XBP1信號(hào),衣霉素處理明顯降低了AML12肝細(xì)胞汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平,STF-083010預(yù)處理完全阻斷了衣霉素對(duì)AML12肝細(xì)胞膽汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平的降低作用,表明IRE1α核酸內(nèi)切酶激活在LPS干擾膽汁酸代謝過程中可能通過下調(diào)肝細(xì)胞膽汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平發(fā)揮保護(hù)性作用。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)孕期LPS通過干擾膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解和緊密連接誘發(fā)母體膽汁酸代謝紊亂,改變膽汁酸譜;OCA通過降低膽汁酸合成、增加膽汁酸分解和增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程對(duì)LPS誘發(fā)膽汁酸代謝紊亂起保護(hù)作用;生物節(jié)律調(diào)控的基因DBP與OCA改善LPS誘發(fā)孕期母體膽汁酸代謝紊亂相關(guān);IRE1α核酸內(nèi)切酶通過降低膽汁酸合成對(duì)LPS誘發(fā)母體膽汁酸代謝紊亂起保護(hù)作用。本研究的發(fā)現(xiàn)將為孕期膽汁酸紊亂的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.2
【圖文】：

圖 2 急性 LPS 暴露對(duì)孕晚期母鼠血清和肝臟總膽汁酸水平的影A：血清總膽汁酸水平；B：肝臟總膽汁酸水平Figure 2 The effect of total bile acid in maternal serum and liver from aexposed mice during pregnancyMice were sacrificed at 6 hours after a single intraperitoneal injection of LPSbody weight) at 15:00 PM of GD17. The levels of total bile acid in maternaliver from mice treated with LPS or saline were detected. All data in the expeexpressed as means ± SEM (n = 6). **P<0.01, compared with the control grou3.1.2 急性 LPS 暴露改變?cè)衅谀甘笱迥懼嶙V為觀察急性 LPS 暴露對(duì)孕晚期母鼠血清膽汁酸譜的影響，在 G

學(xué)博士學(xué)位論文超過 40 %，TCA 和 DCA 含量較高，均超過 10 %，TDCA、DCA、TUDCA 和 CDCA 含量較低，占 1~10 %，GCA 含量最對(duì)照組組相比，在 LPS 處理后 6 h 母鼠血清 TCA 和 TUDCA 構(gòu)學(xué)比較差異有顯著性（P<0.05），但 OCA 預(yù)處理在 LPS 處理和TUDCA構(gòu)成比無明顯影響；在LPS處理后6 h母鼠血清LCA降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有顯著性（P<0.05）（圖 3 ）。

圖 4 急性 LPS 暴露對(duì)孕期母鼠血清初級(jí)膽汁酸的影響A：CA；B：CDCA；C：GCA；D：TCA；E：TCDCAFigure 4 The effect of primary bile acids in maternal serum from acute LPSexposed mice during pregnancyMice were sacrificed at 6 hours after a single intraperitoneal injection of LPS (200 μg/kgbody weight) at 15:00 PM of GD17. The levels of primary bile acids in maternal serumfrom mice treated with LPS and/or saline were detected using AB SCIEX TRIPLEQUAD 5500 SYSTEM. (A) CA；(B) CDCA；(C) GCA；(D) TCA；(E) TCDCA.All data in the experiment were expressed as means ± SEM (n = 6). **P<0.01, comparedwith the control group.

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3 魯旭;韓濤;田W

本文編號(hào)：2752067