【摘要】：四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A,TBBPA)是具有內(nèi)分泌干擾毒性的環(huán)境新型潛在的擬增熱點(diǎn)POPs,是目前應(yīng)用最多的,產(chǎn)量較高的一種小分子溴系阻燃劑,廣泛用于各種電子電器產(chǎn)品、紡織品、泡沫家具及建筑材料等。TBBPA不僅暴露人群廣泛(包括職業(yè)和普通人群),而且暴露方式多樣(包括皮膚接觸、飲食攝取、空氣吸入),在很多自然環(huán)境、社會環(huán)境和多種生物有機(jī)體中普遍檢出,對環(huán)境和生物健康產(chǎn)生嚴(yán)重而持久的影響。TBBPA現(xiàn)已被國際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)在2016年列為可能的2A級致癌物,其暴露增加子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),但目前關(guān)于TBBPA誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤機(jī)制尚無明確認(rèn)識急需深入探究。腫瘤包括實(shí)質(zhì)與間質(zhì)。腫瘤的間質(zhì)在腫瘤微環(huán)境中以癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)為代表的多種輔助性細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的形式協(xié)助實(shí)體瘤的構(gòu)建,CAFs是由腫瘤分泌因子誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)等多種干細(xì)胞分化形成,BMSCs能夠遷移至實(shí)體瘤部位補(bǔ)充腫瘤微環(huán)境中被消耗的CAFs。目前,關(guān)于環(huán)境污染物的腫瘤效應(yīng)主要集中在對實(shí)體腫瘤的研究,關(guān)于腫瘤微環(huán)境的報(bào)道比較少,因此本研究基于TBBPA誘導(dǎo)BMSCs分化為CAFs,建立腫瘤微環(huán)境體系,探究TBBPA暴露促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)和潛在的分子機(jī)理,豐富和完善環(huán)境因子的腫瘤效應(yīng)評價(jià)體系。研究內(nèi)容包括以下幾部分:1.人體血液檢出水平的TBBPA(1.00E-9~1.00E-7 mol/L)暴露BMSCs 6 d和12 d后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測BMSCs的標(biāo)志物Thy-1和TBBPA誘導(dǎo)的BMSCs分化為CAFs的標(biāo)志物a-SMA、Fap、PDGFRA轉(zhuǎn)錄水平的情況。研究結(jié)果證明,TBBPA暴露明顯降低了BMSCs標(biāo)志物Thy-1在mRNA水平的表達(dá),而上調(diào)CAFs分化標(biāo)志物a-SMA和Fap mRNA的表達(dá)。這一結(jié)果在Western blotting檢測a-SMA、Fap蛋白含量的實(shí)驗(yàn)和免疫熒光定位檢測a-SMA的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證,表明人體血液含量的TBBPA暴露能夠誘導(dǎo)BMSCs分化為CAFs。2.為了進(jìn)一步探討TBBPA暴露是否通過誘導(dǎo)BMSCs定向分化為CAFs調(diào)控腫瘤微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,我們采用TBBPA誘導(dǎo)的CAFs構(gòu)建了3種CAFs-EC間接暴露模型。研究收集了TBBPA暴露BMSCs分化后的CAFs上清,并配制成上清含量為25%和50%的條件培養(yǎng)基暴露Ishikawa細(xì)胞。CAFs上清對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖效應(yīng)分別被MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測。結(jié)果表明TBBPA暴露后的CAFs的上清上調(diào)了Ishikawa細(xì)胞的相對克隆率、集落形成率和細(xì)胞存活率,證明BMSCs被TBBPA暴露后通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。3.為了證明TBBPA暴露誘導(dǎo)的CAFs通過旁分泌和細(xì)胞直接接觸作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,我們構(gòu)建了2種CAFs-EC直接暴露模型,通過檢測CAFs旁分泌作用的transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和檢測CAFs-EC直接接觸作用的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探究Ishikawa細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示,CAFs與Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行transwell共培養(yǎng)后,Ishikawa細(xì)胞增殖率明顯升高,表明TBBPA誘導(dǎo)的CAFs通過旁分泌作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的增殖。此外CAFs和Ishikawa細(xì)胞共同培養(yǎng)于24孔板后,Ishikawa細(xì)胞增殖率顯著升高,表明TBBPA誘導(dǎo)的CAFs通過細(xì)胞直接接觸作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。4.綜上研究表明,由TBBPA暴露介導(dǎo)的BMSCs通過分化為CAFs促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究TBBPA暴露誘導(dǎo)BMSCs分化的分子毒性機(jī)理。由于BMSCs分化的調(diào)控與PI3K/Akt、NFκB和TGF-β/Smad通路有關(guān),因此我們檢測了這些通路的靶點(diǎn)蛋白TGF-β受體、p-Smad2/3、Smad2/3、p-AKT和NFκB。研究發(fā)現(xiàn),在TBBPA暴露誘導(dǎo)的CAFs中,TGF-β受體和p-Smad2/3的表達(dá)明顯上調(diào),表明TBBPA可能通過激活TGF-β/Smad通路,促進(jìn)BMSCs分化為CAFs。為了驗(yàn)證TBBPA是否通過介導(dǎo)TGF-β/Smad通路誘導(dǎo)BMSCs的分化,我們采用TGF-β受體的抑制劑SB431542和TBBPA共同處理BMSCs,結(jié)果表明當(dāng)TGF-β受體被抑制后,p-Smad2/3和CAFs分化標(biāo)志物a-SMA、Fap的蛋白表達(dá)水平均明顯降低。本部分研究表明TBBPA通過介導(dǎo)TGF-β/Smad通路激活p-Smad2/3的活性,進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs分化為CAFs。以上研究表明,TBBPA暴露誘導(dǎo)BMSCs分化為CAFs,通過CAFs的旁分泌和細(xì)胞直接接觸作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,這是通過TBBPA激活BMSCs的TGF-β/Smad通路完成的。本研究探討了TBBPA通過調(diào)控BMSCs分化,影響腫瘤微環(huán)境變化,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的毒性機(jī)理,補(bǔ)充和完善了環(huán)境毒性因子TBBPA的腫瘤效應(yīng)評價(jià)體系。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖 1.1 TBBPA 分子結(jié)構(gòu)式1.1 The molecular structural formula of T發(fā)展最多的一種溴系阻燃劑（約 60%

圖 1.2 甲狀腺素分子結(jié)構(gòu)式[22]Figure 1.2 The molecular structural formula of thyroid hormo人員發(fā)現(xiàn) TBBPA 是通過增強(qiáng)雌激素活性內(nèi)分泌功胞暴露于濃度梯度的TBBPA后，發(fā)現(xiàn)濃度為10-6M T素活性顯著高于天然雌激素E2的活性，特別地暴露

圖 1.3 腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞組成[46]Figure 1.3 The cells in tumor microenvironment質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤靶向轉(zhuǎn)移中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, M

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2749907