【摘要】：目的:雌激素作為一種重要的甾體類激素,廣泛參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。有研究表明,血液雌激素變化與雌性動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)胃饑餓素(GHRL)基因表達(dá)呈正相關(guān),說明雌激素可能參與GHRL基因表達(dá)的調(diào)控。多囊卵巢綜合征(PCOS)是人類婦科常見病,病癥之一是血液中雄激素水平高,而雌激素水平低。認(rèn)為PCOS與血液胃饑餓素(GHRL)有關(guān)。本研究分為兩部分。第一部分運(yùn)用Meta統(tǒng)計(jì)分析方法,分析人外周血胃饑餓素水平與PCOS關(guān)系研究。第二部分研究以綿羊輸卵管上皮細(xì)胞為材料,研究雌激素調(diào)控輸卵管上皮胃饑餓素基因表達(dá)信號(hào)通路,為研究雌激素、胃饑餓素、多囊卵巢綜合征關(guān)系奠定基礎(chǔ)。本文首先檢索PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫2015年2月之前的相關(guān)文獻(xiàn),搜索關(guān)鍵詞為Ghrelin(GHRL)和PCOS,按照Meta分析方法要求進(jìn)行搜索,共獲得符合條件的20篇研究文獻(xiàn)。采用Meta分析法,分析了與這些文獻(xiàn)對(duì)應(yīng)的20項(xiàng)研究內(nèi)容,這些研究涉及894例多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和574例正常女性。分析顯示,PCOS患者的血液胃饑餓素(GHRL)水平顯著低于正常女性對(duì)照組,標(biāo)準(zhǔn)差(SMD)為-0.71(95%CI:-1.20,-0.23)。其次,通過分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)手段,研究雌激素誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞GHRL表達(dá)過程中的GPER/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路。具體如下:建立綿羊輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系。采用胰酶消化法獲得綿羊輸卵管上皮細(xì)胞,進(jìn)行原代培養(yǎng),通過改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境增加綿羊輸卵管上皮細(xì)胞的純度。通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光及western blot方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。同時(shí),分別在基因水平和蛋白水平檢測綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中GPER、ERα、ERβ的表達(dá)情況。免疫熒光和Western blot檢測傳代細(xì)胞上皮標(biāo)志CK18和E-cadherin,確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。免疫組化結(jié)果顯示綿羊輸卵管組織中GPER為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)著色,ERα及ERβ分布于綿羊輸卵管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核,且ERβ呈弱表達(dá)。用傳代綿羊輸卵管上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料,分別在基因水平和蛋白水平觀察GHRL在綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中有GHRL基因表達(dá),免疫組化結(jié)果顯示GHRL蛋白主要表達(dá)在黏膜層的上皮細(xì)胞內(nèi)。分別用不同濃度的GPER受體激動(dòng)劑G-1和雌激素處理細(xì)胞,并在不同時(shí)間點(diǎn)收樣,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GHRL基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示G-1和E_2均能顯著上調(diào)GHRL的表達(dá)水平,1×10~(-8)mol/L E_2誘導(dǎo)組和1×10~(-7)mol/L G-1誘導(dǎo)組GHRL相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。最佳誘導(dǎo)劑量的E_2和G-1分別處理細(xì)胞6h和3h后,GHRL相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。為了驗(yàn)證E_2和G-1與輸卵管上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控關(guān)系,分別使用E_2和G-1處理細(xì)胞后,分別檢測輸卵管上皮細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA mRNA表達(dá)量變化。結(jié)果表明,最適劑量的E_2和G-1處理細(xì)胞后PCNA表達(dá)水平隨時(shí)間增加而升高,呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。取同批次綿羊輸卵管上皮細(xì)胞,使用最佳濃度17-β雌二醇處理細(xì)胞,然后利用western blot方法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測MAPK/ERK通路中蛋白組分表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示,其磷酸化水平p-ERK蛋白表達(dá)量從5 min開始逐漸升高,持續(xù)升高至30 min時(shí),達(dá)到峰值。取同批次綿羊輸卵管上皮細(xì)胞,分別加入最適劑量E_2和GPER激動(dòng)劑G-1,在30 min時(shí)提取細(xì)胞總蛋白,檢測MAPK/ERK通路中蛋白組分表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示,G-1處理組和E_2處理組ERK總蛋白表達(dá)量無明顯變化,G-1處理組和E_2處理組磷酸化水平p-ERK蛋白表達(dá)量均升高,且明顯高于對(duì)照組。免疫組化結(jié)果顯示,綿羊輸卵管黏膜層上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞均有ERK1/2蛋白表達(dá),主要著色蛋白位于胞質(zhì),少數(shù)胞核也有陽性表達(dá)。分別加入GPER的激動(dòng)劑G-1、GPER激動(dòng)劑G-1+MAPK/ERK抑制劑U0126(30μM)及E_2+MAPK/ERK抑制劑U0126(30μM)處理細(xì)胞6h后,提取細(xì)胞總RNA,利用RT-qPCR方法檢測各組GHRL基因表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示,E_2處理組與G-1處理組均顯示出明顯的促進(jìn)GHRL表達(dá)的效應(yīng)(P0.01),G-1的促進(jìn)表達(dá)能力高于E_2(P0.05)。17-β雌二醇和G-1的促進(jìn)表達(dá)效應(yīng)均能夠被U0126阻斷(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R711.75
【圖文】：

圖 1 GHRL 發(fā)現(xiàn)過程[5]Fig 1. The GHRL discovery processGHRL 基因及蛋白乳動(dòng)物中，GHRL是一種促進(jìn)食欲，并協(xié)調(diào)能量和生殖活動(dòng)平衡的胃腸布在胃組織中。具有活性的GHRL要經(jīng)歷從GHRL基因到GHRL蛋白的修飾和進(jìn)化過程。 GHRL 基因結(jié)構(gòu)及多態(tài)性的 GHRL 基因位于染色體 3p25-26，包括 4 個(gè)內(nèi)含子和 5 個(gè)外顯子，in 基因也由 5 個(gè)外顯子組成[6,7]。雞的 GHRL 基因 DNA 序列全長 27064 個(gè)內(nèi)含子連接 5 個(gè)外顯子組成。人的 GHRL 第一個(gè)外顯子不編碼蛋白顯子只有 20bp，編碼非翻譯區(qū)的一部分。HRL 核心啟動(dòng)子長約 200bp，上游具有一個(gè)長約 5000bp 的調(diào)控序列 基因表達(dá)。

圖 2 人和鼠的 GHRL 結(jié)構(gòu)[5]Fig. 2 The GHRL structure of human and mouse化 GHRL 的過程中，根據(jù)第三位絲氨酸是否酰辛�；� GHRL（C8:0）、脫�；� GHRL（C10:1）。這些 GHRL 由 27 或 28 個(gè)氨基酸組氨基酸組成的 GHRL 多羧基端（COOH-）的。GHRL 主要有兩種分子存在形式，即第 3辛�；�，N 端辛�；瘜�(duì)生物活性具有重程中，先產(chǎn)生由 117 個(gè)氨基酸組成的前體，然的活性 GHRL。GHRL 前體 N 端的前 23 個(gè)氨 24-51（24-50）位的 28（或 27）個(gè)氨基酸為端 P-R，即脯氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)為其識(shí)別部位化的 GHRL 一般不具備生物活性[5]。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2740770