【摘要】：背景自1978年第一例試管嬰兒Louise Brown在英國成功誕生以來,輔助生殖技術(shù)(Assisted reproductive technology,ART)迅速在世界范圍內(nèi)傳播開來。1988年3月我國首例試管嬰兒于北醫(yī)三院誕生。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前全球約有500余萬名試管嬰兒誕生~([1])。三十年來,輔助生殖技術(shù)得到了迅猛發(fā)展,目前的輔助生殖技術(shù)及其衍生技術(shù)包括:人工授精、體外受精與胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI)、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)、線粒體移植、未成熟卵體外成熟技術(shù)(In vitro maturation,IVM)、胚胎冷凍復(fù)蘇技術(shù)、卵母細(xì)胞與卵巢組織冷凍技術(shù)、人工輔助孵出等。近年來隨著女性生育年齡的推遲及卵巢癌、乳腺癌等疾病的影響,女性生育力保存得到了廣泛的關(guān)注。目前卵母細(xì)胞玻璃化冷凍結(jié)合IVM培養(yǎng)技術(shù)在保存女性生育力方面取得了可喜成果,盡管如此,這些技術(shù)的安全性和可靠性仍有待進(jìn)一步評估。卵丘細(xì)胞是包裹在卵母細(xì)胞外層的顆粒細(xì)胞,通過提供卵母細(xì)胞發(fā)育過程中必須的營養(yǎng)物質(zhì)、信號分子和代謝產(chǎn)物調(diào)控卵泡發(fā)育,對卵母細(xì)胞成熟尤其是細(xì)胞核和胞質(zhì)成熟有促進(jìn)作用。之前的研究表明通過液相色譜質(zhì)譜法檢測卵丘細(xì)胞中蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)可發(fā)育為囊胚組和非囊胚組蛋白表達(dá)存在差異~([2])。這些差異蛋白不僅參與卵泡發(fā)育,還可能參與部分免疫反應(yīng),在胚胎植入過程中起一定的作用~([3]),此外,卵丘細(xì)胞還可吸引、捕獲甚至篩選精子、觸發(fā)精子獲能、頂體反應(yīng)并防止透明帶僵化~([4;5])。此外,人卵丘細(xì)胞還可產(chǎn)生胰島素樣生長因子Ⅱ(Insulin-like growth factor,IGF-Ⅱ),其與卵泡的發(fā)育、優(yōu)勢卵泡的選擇及卵母細(xì)胞的成熟有著密切的聯(lián)系~([6])。目前關(guān)于卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞冷凍過程中的作用研究較少,Jin等人的研究表明卵丘細(xì)胞可顯著增強(qiáng)成熟卵母細(xì)胞凍存后的存活率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率和臨床妊娠率~([7])。然而,Minasi等人報(bào)告玻璃化冷凍解凍后卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物和裸卵的存活率無明顯差異~([8])。國內(nèi)李娜等人的研究顯示卵丘細(xì)胞保留與否不影響玻璃化凍融后卵母細(xì)胞的存活率,但帶有卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞體外成熟率明顯高于裸卵~([9])。玻璃化冷凍對未成熟卵母細(xì)胞冷凍的影響的研究較匱乏。對牛GV期卵母細(xì)胞冷凍的研究顯示,相比新鮮對照組,凍融后卵母細(xì)胞內(nèi)某些第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)及成熟促進(jìn)因子(Maturation promoting factor,MPF)含量下降,導(dǎo)致體外成熟過程中GV期卵母細(xì)胞成熟率降低,可能因玻璃化冷凍過程中細(xì)胞膜損傷、胞質(zhì)流失導(dǎo)致~([10])。卵丘細(xì)胞對未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育潛能的影響仍有待進(jìn)一步評估,同時(shí)關(guān)于冷凍復(fù)蘇過程對卵母細(xì)胞損傷的機(jī)制需要更為深入的研究。本研究以小鼠和人類未成熟卵母細(xì)胞為研究對象,系統(tǒng)研究玻璃化冷凍時(shí)卵丘細(xì)胞存在與否及冷凍時(shí)期對小鼠未成熟卵母細(xì)胞解凍存活率、體外成熟率、受精率及后續(xù)胚胎發(fā)育潛能的影響。以人類未成熟卵母細(xì)胞為研究對象,研究玻璃化冷凍時(shí)卵丘細(xì)胞存在與否及冷凍時(shí)期對未成熟卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的影響。采用高通量測序技術(shù)研究玻璃化冷凍對未成熟卵母細(xì)胞全基因組表達(dá)譜的影響,旨在尋找未成熟卵母細(xì)胞冷凍的最佳時(shí)期和冷凍保存方案,為女性生育力保存提供理論依據(jù)。第一部分卵丘細(xì)胞對小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育的影響研究目的1.探討有無卵丘細(xì)胞在玻璃化冷凍過程中對小鼠未成熟卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育的影響。2.探討未成熟卵母細(xì)胞冷凍應(yīng)先進(jìn)行體外成熟再冷凍還是先冷凍再進(jìn)行體外成熟。材料與方法收集小鼠未成熟卵母細(xì)胞,將其分為五組:組1:卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)體外成熟后冷凍;2:裸卵(DO)體外成熟后冷凍;組3:裸卵(DO)體外成熟;組4:卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)冷凍后體外成熟;組5:裸卵(DO)冷凍后體外成熟。以組3為對照組;將五組體外培養(yǎng)后得到成熟卵母細(xì)胞用同種屬雄鼠精子進(jìn)行體外受精并培養(yǎng)至囊胚期。觀察比較五組的解凍存活率、成熟率、受精率、卵裂率、囊胚形成率等,并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.DO體外成熟組相比其他四組,其MII率、解凍存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.COC體外成熟后冷凍組的MII率(72.33%VS60.39%)、解凍存活率(79.13%VS52.46%)均高于DO體外成熟后冷凍組(P0.05),受精率(53.85%VS46.88%)、卵裂率(61.22%VS60.00%)、囊胚形成率(14.29%VS3.33%)兩組間雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但COC體外成熟后冷凍組仍有高于DO體外成熟后冷凍組的趨勢。3.DO冷凍后體外成熟組與COC冷凍后體外成熟組相比,其MII率(45.57%VS62.50%)、解凍存活率(48.47%VS68.38%)均較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.COC體外成熟后冷凍組的MII率(72.33%VS62.50%)、解凍存活率(79.13%VS68.38%)、受精率(53.85%VS64.00%)囊胚形成率(14.29%VS25.00%)與COC冷凍后體外成熟組無明顯差異(P0.05)。5.DO體外成熟后冷凍組的解凍存活率(52.46%VS48.47%,P0.05)高于DO冷凍后體外成熟組,但囊胚形成率(3.33%)低于DO冷凍后體外成熟組(12.00%)和DO直接體外成熟組(26.98%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.裸化未成熟卵母細(xì)胞先行體外成熟培養(yǎng)后再冷凍,其成熟率優(yōu)于先冷凍后體外成熟,與未冷凍卵母細(xì)胞相比,冷凍過程明顯降低卵母細(xì)胞隨后胚胎發(fā)育潛能。2.無論在卵母細(xì)胞先行體外成熟培養(yǎng)后冷凍或先冷凍后體外成熟培養(yǎng),卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞冷凍均有保護(hù)作用,有利于提高其隨后的受精、胚胎繼續(xù)發(fā)育潛能。第二部分卵丘細(xì)胞在玻璃化冷凍過程中對人類未成熟卵母細(xì)胞紡錘體及染色體的影響研究目的通過比較有無卵丘細(xì)胞在人類未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的紡錘體和染色體分布情況,探討卵丘細(xì)胞對未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的過程中紡錘體及染色體的影響。材料與方法收集我中心行ICSI患者的未成熟卵母細(xì)胞,將人類未成熟卵母細(xì)胞分為先冷凍再IVM組和先IVM再冷凍組,再將兩組根據(jù)有無卵丘細(xì)胞分為裸卵(DO)、卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)組,以新鮮裸卵直接在體外行IVM為對照,將五組卵母細(xì)胞玻璃化凍融后進(jìn)行紡錘體和染色體免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)五組紡錘體及染色體正常形態(tài)率。結(jié)果1.與先冷凍再IVM DO組相比,先冷凍再IVM COC組紡錘體(60.00%VS11.76%)及染色體(45.00%%VS11.76%)正常率明顯增高;2.與新鮮DO組相比,先冷凍再IVM DO組紡錘體(78.26%VS11.76%)及染色體(65.22%VS11.76%)正常率明顯降低;而先IVM再冷凍DO組紡錘體(55.56%VS78.26%)和染色體(61.11%VS65.22%)正常率與新鮮DO組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.與先IVM再冷凍COC組相比,先冷凍再IVM COC組紡錘體(85.71%VS60.00%)及染色體(66.67%VS45.00%)正常率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論在DO未成熟卵母細(xì)胞中,先體外成熟后冷凍,對卵母細(xì)胞的紡錘體損傷較先冷凍再體外成熟培養(yǎng)要小,而有卵丘細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞,先體外成熟后冷凍還是先冷凍后體外成熟培養(yǎng),紡錘體的形態(tài)均正常,卵丘細(xì)胞對未成熟卵母細(xì)胞的冷凍有保護(hù)作用,可以減緩冷凍保護(hù)劑滲透到卵母細(xì)胞的速度,減少冷凍保護(hù)劑的毒性作用。第三部分玻璃化冷凍/解凍對人未成熟卵母細(xì)胞全基因組表達(dá)的影響研究目的通過比較人類未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后行體外成熟培養(yǎng)與直接體外成熟至成熟期的全基因組表達(dá)的差異,篩選影響卵母細(xì)胞冷凍的關(guān)鍵基因和相應(yīng)的調(diào)控通路,探討玻璃化冷凍對未成熟卵母細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。材料與方法收集于我中心行卵胞漿內(nèi)單精子注射患者的廢棄未成熟卵母細(xì)胞,部分直接行體外成熟培養(yǎng),部分先進(jìn)行玻璃化冷凍再行體外成熟培養(yǎng),用全基因組表達(dá)譜芯片對兩組成熟期卵母細(xì)胞冷凍后基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果1.卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后全基因組表達(dá)譜芯片分析中共獲得2倍以上差異差異表達(dá)基因765個(gè),其中上調(diào)基因103個(gè),下調(diào)基因662個(gè)。2.細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、多細(xì)胞組織過程、定位、發(fā)育過程、信號、生物過程的積極調(diào)節(jié)、生物過程負(fù)調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程等參與了冷凍后下調(diào)基因表達(dá)的生物過程調(diào)控;3.細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜部分、膜封閉腔、大分子配合物、細(xì)胞外區(qū)部分等參與了冷凍后下調(diào)基因表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞組成調(diào)控;結(jié)合、催化活性、分子功能的調(diào)整、轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、信號傳導(dǎo)蛋白活性、分子傳導(dǎo)蛋白活性、結(jié)構(gòu)分子活性等參與冷凍后下調(diào)基因表達(dá)的分子功能調(diào)控。4.癌癥通路、人類乳頭瘤病毒感染通路、RNA代謝通路、Hippo信號通路、mtor信號通路、Wnt信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、ECM受體相互作用通路參與了冷凍后基因的調(diào)控通路。結(jié)論與直接體外成熟的卵母細(xì)胞相比,在未成熟期玻璃化冷凍后體外成熟的卵母細(xì)胞存在多個(gè)差異表達(dá)基因,這些基因變化與卵母細(xì)胞質(zhì)量、細(xì)胞器組成和多種調(diào)節(jié)通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714.8
【圖文】：

圖 2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過程示意圖.2 卵母細(xì)胞玻璃化解凍過程：解凍液1（WS1）1ml 放入37℃不通氣的培養(yǎng)箱中平衡2h以上，3、4（WS2，WS3,WS4）各500ul在室溫條件下平衡1 h；解凍時(shí)otop，迅速將載桿的帽拔掉，將載桿末端的塑料薄片插入預(yù)熱的將卵母細(xì)胞移入WS2，3 min之后移入WS3中5 min，最后轉(zhuǎn)入WS卵母細(xì)胞移入G-IVF Plus 培養(yǎng)液中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2h。WS1

圖 3 卵母細(xì)胞解凍過程示意圖.3 精子的獲取及常規(guī)體外受精1.3.3.1 首先，在實(shí)驗(yàn)前一下午將含有 G-IVF Plus 及 G-1 P放入培養(yǎng)箱(37℃，6％CO2)中過夜平衡。1.3.3.2 挑取一只性成熟體貌正常的雄性小鼠，斷頸處死后取精管，放入 G-MOPS Plus 中清洗兩次，并用 1ml 無菌注射器將輸將輸精管中精子擠出，輕輕晃動(dòng)液體使精子分散。1.3.3.3 用 9 寸巴斯德吸管將 G-IVF Plus 液滴吸入盛有梯度將其傾斜放入培養(yǎng)箱，使精子上游 15-30min。1.3.3.4 將小白管中上層液體輕輕地吸出 3-4 mL，吸取適量原細(xì)胞的微滴中，可以看到卵母細(xì)胞被精子推著轉(zhuǎn)動(dòng)，說明精子1.3.3.5 體外受精 4-6 h 之后觀察雙原核及第二極體排出情況胚胎移入 G-1 Plus 卵裂培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48 小時(shí)后觀察胚胎情胎移入 G-2 Plus 囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)。

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本文編號：2738560