【摘要】：目的:外陰癌在女性生殖器官惡性腫瘤中居第4位,其中以原發(fā)性鱗狀上皮癌為主。近年來(lái)外陰鱗狀細(xì)胞癌(Vulvar squamous cell carcinoma,VSCC)的發(fā)病率有逐年升高,威脅著老年女性的健康,晚期外陰鱗癌的五年生存率僅為20%。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本多于兩百個(gè)核苷酸,不翻譯蛋白質(zhì),但能在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后三個(gè)層面上經(jīng)多種作用機(jī)制對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的非編碼RNA。近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn),許多l(xiāng)ncRNAs的差異性表達(dá)或功能異常與包括腫瘤和自身免疫性疾病在內(nèi)的多種疾病關(guān)系緊密,且某些lncRNAs已被證實(shí)能夠與mRNA、microRNA、相應(yīng)的靶基因及蛋白質(zhì)之間進(jìn)行相互調(diào)控,通過(guò)某些信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,和細(xì)胞分化、周期改變、凋亡調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)都有一定聯(lián)系。PCBP1-AS1(poly C binding protein-1 antisense RNA1)是多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1的反義lncRNA。反義lncRNA能和其它轉(zhuǎn)錄物的特定核苷酸序列互補(bǔ),經(jīng)多種作用機(jī)制在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,并可能在疾病發(fā)生中發(fā)揮獨(dú)特作用。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5(TNF receptor-associated factor 5,TRAF5)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,既往的研究結(jié)果表明,TRAF5可以介導(dǎo)LT-βR、CD40、CD30、CD27等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,對(duì)細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)的發(fā)生和免疫調(diào)控等都有一定的作用。本研究旨在探究PCBP1-AS1在外陰鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況,驗(yàn)證PCBP1-AS1可以通過(guò)TRAF5介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路,調(diào)控外陰鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究方法:采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)檢測(cè)19對(duì)外陰鱗狀細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的癌旁正常外陰組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達(dá)水平,采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與外陰鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理資料的關(guān)系分析;采用蛋白印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)19對(duì)外陰鱗狀細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的癌旁正常外陰組織中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法成功地在外陰鱗癌SW954細(xì)胞中外源性改變PCBP1-AS1和TRAF5的表達(dá)后,采用qRT-PCR法檢測(cè)PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達(dá)水平,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,Annexin V-FITCPI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,初步驗(yàn)證PCBP1-AS1和TRAF5在外陰鱗癌SW954細(xì)胞中的作用形式和生物學(xué)功能。外源性改變PCBP1-AS1和TRAF5的表達(dá)后,WB法檢測(cè)TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達(dá)水平,NF-κB激活—核轉(zhuǎn)運(yùn)熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB的活性變化;在SW954細(xì)胞中成功改變PCBP1-AS1和TRAF5表達(dá)的基礎(chǔ)上,分別應(yīng)用NF-κB信號(hào)通路激活劑和抑制劑,進(jìn)行NF-κB激活—核轉(zhuǎn)運(yùn)熒光標(biāo)記法、CCK-8、Annexin V-FITCPI、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲小室等實(shí)驗(yàn),探究PCBP1-AS1是否通過(guò)TRAF5介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路對(duì)外陰鱗癌SW954細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。結(jié)果:第一部分:1、VSCC組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達(dá)水平均低于相應(yīng)的癌旁正常外陰組織;2、VSCC組織中PCBP1-AS1的表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原密切相關(guān),TRAF5 mRNA的表達(dá)與患者FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);3、VSCC組織中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達(dá)水平均明顯低于其相應(yīng)的癌旁正常外陰組織。第二部分:1、應(yīng)用shRNA技術(shù)成功在SW954細(xì)胞中敲低TRAF5的表達(dá),選取沉默效率較高的TRAF5-RNAi-0/SW954細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);2、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)后TRAF5 mRNA的表達(dá)水平隨之上調(diào);而TRAF5的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后PCBP1-AS1的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化;3、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制SW954細(xì)胞增殖,而TRAF5的表達(dá)下調(diào)能夠顯著促進(jìn)SW954細(xì)胞增殖;4、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠顯著促進(jìn)SW954細(xì)胞凋亡,而TRAF5的表達(dá)下調(diào)能夠顯著抑制SW954細(xì)胞凋亡;5、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制SW954細(xì)胞遷移,而TRAF5的表達(dá)下調(diào)能夠顯著促進(jìn)SW954細(xì)胞遷移;6、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制SW954細(xì)胞侵襲,而TRAF5的表達(dá)下調(diào)能夠顯著促進(jìn)SW954細(xì)胞侵襲。第三部分:1、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)后TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達(dá)水平均隨之明顯上調(diào);而TRAF5的表達(dá)下調(diào)后p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達(dá)水平均隨之明顯下調(diào);2、PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)能夠顯著升高NF-κB的活性,而TRAF5的表達(dá)下調(diào)能夠顯著降低NF-κB的活性;3、應(yīng)用NF-κB信號(hào)通路激活劑后NF-κB的活性顯著升高,而應(yīng)用NF-κB信號(hào)通路抑制劑后NF-κB的活性顯著降低,驗(yàn)證了NF-κB信號(hào)通路的激活和抑制模型的構(gòu)建成功;4、NF-κB信號(hào)通路的激活能夠抑制SW954細(xì)胞增殖,NF-κB信號(hào)通路的抑制能夠促進(jìn)SW954細(xì)胞增殖;NF-κB信號(hào)通路的激活能夠消減TRAF5的表達(dá)下調(diào)引起的SW954細(xì)胞增殖能力的提高,NF-κB信號(hào)通路的抑制能夠抵抗PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)引起的SW954細(xì)胞增殖能力的下降;5、NF-κB信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)SW954細(xì)胞凋亡,NF-κB信號(hào)通路的抑制能夠抑制SW954細(xì)胞凋亡;NF-κB信號(hào)通路的激活能夠抵抗TRAF5的表達(dá)下調(diào)引起的SW954細(xì)胞凋亡率的下降,NF-κB信號(hào)通路的抑制能夠消減PCBP1-AS1的表達(dá)上調(diào)引起的SW954細(xì)胞凋亡率的升高;6、NF-κB信號(hào)通路的激活和抑制對(duì)SW954細(xì)胞的遷移能力無(wú)明顯影響;7、NF-κB信號(hào)通路的激活和抑制對(duì)SW954細(xì)胞的侵襲能力無(wú)明顯影響。結(jié)論:1、PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA在VSCC組織中表達(dá)均降低;在VSCC組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達(dá)均與臨床病理特征密切相關(guān);VSCC組織中存在著NF-κB/p65和NF-κB/c-Rel信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制;2、TRAF5是PCBP1-AS1的靶基因,以PCBP1-AS1-TRAF5 mRNA基因?qū)Φ男问桨l(fā)揮作用;PCBP1-AS1可能作為一種抑癌基因,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,影響VSCC的發(fā)生發(fā)展;3、TRAF5介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與了PCBP1-AS1在VSCC的發(fā)展進(jìn)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡能力的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.35
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 組織中均低表達(dá)用 qRT-PCR 法對(duì) 19 對(duì) VSCC 和相應(yīng)的癌旁的正常外陰組織內(nèi) PCBAF5 mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖 1.1）顯示 VSCC 組織中 PCB水平（0.465±0.384）明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織（1.321±0.707），意義（P<0.001）；同時(shí) VSCC 組織內(nèi) TRAF5 mRNA 的表達(dá)（0.495±低于其相應(yīng)的癌旁的正常外陰組織（1.336±1.081），差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)P<0.001）。

圖 1.2 PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 組織中均低表達(dá)BP1-AS1 在人 NNEDV 組織及其相應(yīng)的病變旁正常外陰組織中的相對(duì)表達(dá)量 B. mRNA 在人 NNEDV 組織及其相應(yīng)的病變旁正常外陰組織中的相對(duì)表達(dá)量PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 和 NNEDV 組織中的表達(dá)關(guān)系用 Pearson 線性相關(guān)分析法分別對(duì) PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VV 組織中相對(duì)表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在 VSCC 組織中 PCBAF5 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯線性相關(guān)性（P>0.05），在NNEDV組織內(nèi)PCBAF5 mRNA 的表達(dá)之間為中度正相關(guān)的關(guān)系（R=0.501，P<0.05）（圖

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本文編號(hào)：2731737