發(fā)布時間：2020-06-27 10:58

【摘要】：目的:外陰癌在女性生殖器官惡性腫瘤中居第4位,其中以原發(fā)性鱗狀上皮癌為主。近年來外陰鱗狀細胞癌(Vulvar squamous cell carcinoma,VSCC)的發(fā)病率有逐年升高,威脅著老年女性的健康,晚期外陰鱗癌的五年生存率僅為20%。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是轉錄本多于兩百個核苷酸,不翻譯蛋白質,但能在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后三個層面上經(jīng)多種作用機制對基因表達進行調控的非編碼RNA。近年來的大量研究發(fā)現(xiàn),許多l(xiāng)ncRNAs的差異性表達或功能異常與包括腫瘤和自身免疫性疾病在內的多種疾病關系緊密,且某些lncRNAs已被證實能夠與mRNA、microRNA、相應的靶基因及蛋白質之間進行相互調控,通過某些信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,和細胞分化、周期改變、凋亡調控及免疫調節(jié)都有一定聯(lián)系。PCBP1-AS1(poly C binding protein-1 antisense RNA1)是多聚胞嘧啶結合蛋白1的反義lncRNA。反義lncRNA能和其它轉錄物的特定核苷酸序列互補,經(jīng)多種作用機制在轉錄和轉錄后水平上對靶基因表達進行調控,并可能在疾病發(fā)生中發(fā)揮獨特作用。腫瘤壞死因子受體相關因子5(TNF receptor-associated factor 5,TRAF5)是細胞內重要的信號轉導蛋白,既往的研究結果表明,TRAF5可以介導LT-βR、CD40、CD30、CD27等的信號轉導進而激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信號轉導通路,對細胞的凋亡、炎癥反應的發(fā)生和免疫調控等都有一定的作用。本研究旨在探究PCBP1-AS1在外陰鱗狀細胞癌中的表達情況,驗證PCBP1-AS1可以通過TRAF5介導的NF-κB信號通路,調控外陰鱗癌細胞的生物學行為。研究方法:采用實時定量聚合酶鏈反應法(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)檢測19對外陰鱗狀細胞癌組織和相應的癌旁正常外陰組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達水平,采用Fisher精確檢驗進行PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的相對表達水平與外陰鱗狀細胞癌患者臨床病理資料的關系分析;采用蛋白印跡法(Western blot,WB)檢測19對外陰鱗狀細胞癌組織和相應的癌旁正常外陰組織中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達水平。通過脂質體轉染方法成功地在外陰鱗癌SW954細胞中外源性改變PCBP1-AS1和TRAF5的表達后,采用qRT-PCR法檢測PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達水平,CCK-8法檢測細胞增殖情況,Annexin V-FITCPI法檢測細胞凋亡情況,劃痕實驗檢測細胞遷移能力,Transwell法檢測細胞侵襲能力,初步驗證PCBP1-AS1和TRAF5在外陰鱗癌SW954細胞中的作用形式和生物學功能。外源性改變PCBP1-AS1和TRAF5的表達后,WB法檢測TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達水平,NF-κB激活—核轉運熒光標記法檢測細胞中NF-κB的活性變化;在SW954細胞中成功改變PCBP1-AS1和TRAF5表達的基礎上,分別應用NF-κB信號通路激活劑和抑制劑,進行NF-κB激活—核轉運熒光標記法、CCK-8、Annexin V-FITCPI、劃痕實驗、Transwell侵襲小室等實驗,探究PCBP1-AS1是否通過TRAF5介導的NF-κB信號通路對外陰鱗癌SW954細胞生物學行為進行調控。結果:第一部分:1、VSCC組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達水平均低于相應的癌旁正常外陰組織;2、VSCC組織中PCBP1-AS1的表達水平與患者的腫瘤大小、分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、遠處轉移和鱗狀細胞癌相關抗原密切相關,TRAF5 mRNA的表達與患者FIGO分期和淋巴結轉移密切相關;3、VSCC組織中TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達水平均明顯低于其相應的癌旁正常外陰組織。第二部分:1、應用shRNA技術成功在SW954細胞中敲低TRAF5的表達,選取沉默效率較高的TRAF5-RNAi-0/SW954細胞用于后續(xù)實驗;2、PCBP1-AS1的表達上調后TRAF5 mRNA的表達水平隨之上調;而TRAF5的表達上調或下調后PCBP1-AS1的表達水平均無明顯變化;3、PCBP1-AS1的表達上調能夠顯著抑制SW954細胞增殖,而TRAF5的表達下調能夠顯著促進SW954細胞增殖;4、PCBP1-AS1的表達上調能夠顯著促進SW954細胞凋亡,而TRAF5的表達下調能夠顯著抑制SW954細胞凋亡;5、PCBP1-AS1的表達上調能夠顯著抑制SW954細胞遷移,而TRAF5的表達下調能夠顯著促進SW954細胞遷移;6、PCBP1-AS1的表達上調能夠顯著抑制SW954細胞侵襲,而TRAF5的表達下調能夠顯著促進SW954細胞侵襲。第三部分:1、PCBP1-AS1的表達上調后TRAF5、p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達水平均隨之明顯上調;而TRAF5的表達下調后p65、p-p65、c-Rel和IκBα蛋白的表達水平均隨之明顯下調;2、PCBP1-AS1的表達上調能夠顯著升高NF-κB的活性,而TRAF5的表達下調能夠顯著降低NF-κB的活性;3、應用NF-κB信號通路激活劑后NF-κB的活性顯著升高,而應用NF-κB信號通路抑制劑后NF-κB的活性顯著降低,驗證了NF-κB信號通路的激活和抑制模型的構建成功;4、NF-κB信號通路的激活能夠抑制SW954細胞增殖,NF-κB信號通路的抑制能夠促進SW954細胞增殖;NF-κB信號通路的激活能夠消減TRAF5的表達下調引起的SW954細胞增殖能力的提高,NF-κB信號通路的抑制能夠抵抗PCBP1-AS1的表達上調引起的SW954細胞增殖能力的下降;5、NF-κB信號通路的激活能夠促進SW954細胞凋亡,NF-κB信號通路的抑制能夠抑制SW954細胞凋亡;NF-κB信號通路的激活能夠抵抗TRAF5的表達下調引起的SW954細胞凋亡率的下降,NF-κB信號通路的抑制能夠消減PCBP1-AS1的表達上調引起的SW954細胞凋亡率的升高;6、NF-κB信號通路的激活和抑制對SW954細胞的遷移能力無明顯影響;7、NF-κB信號通路的激活和抑制對SW954細胞的侵襲能力無明顯影響。結論:1、PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA在VSCC組織中表達均降低;在VSCC組織中PCBP1-AS1和TRAF5 mRNA的表達均與臨床病理特征密切相關;VSCC組織中存在著NF-κB/p65和NF-κB/c-Rel信號轉導通路的抑制;2、TRAF5是PCBP1-AS1的靶基因,以PCBP1-AS1-TRAF5 mRNA基因對的形式發(fā)揮作用;PCBP1-AS1可能作為一種抑癌基因,抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲,促進腫瘤細胞凋亡,影響VSCC的發(fā)生發(fā)展;3、TRAF5介導的NF-κB信號通路參與了PCBP1-AS1在VSCC的發(fā)展進程中對腫瘤細胞增殖和凋亡能力的調控。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.35
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結果PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 組織中均低表達用 qRT-PCR 法對 19 對 VSCC 和相應的癌旁的正常外陰組織內 PCBAF5 mRNA 的表達水平進行檢測，結果（圖 1.1）顯示 VSCC 組織中 PCB水平（0.465±0.384）明顯低于其相應的癌旁組織（1.321±0.707），意義（P<0.001）；同時 VSCC 組織內 TRAF5 mRNA 的表達（0.495±低于其相應的癌旁的正常外陰組織（1.336±1.081），差異在統(tǒng)計學P<0.001）。

圖 1.2 PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 組織中均低表達BP1-AS1 在人 NNEDV 組織及其相應的病變旁正常外陰組織中的相對表達量 B. mRNA 在人 NNEDV 組織及其相應的病變旁正常外陰組織中的相對表達量PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VSCC 和 NNEDV 組織中的表達關系用 Pearson 線性相關分析法分別對 PCBP1-AS1 和 TRAF5 mRNA 在 VV 組織中相對表達的關系進行分析，結果顯示在 VSCC 組織中 PCBAF5 mRNA的表達無明顯線性相關性（P>0.05），在NNEDV組織內PCBAF5 mRNA 的表達之間為中度正相關的關系（R=0.501，P<0.05）（圖

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本文編號：2731737