【摘要】：【背景】子宮內膜癌(endometrial carcinoma,EC)為女性重要惡性腫瘤之一,約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤的20-30%。子宮內膜癌多發(fā)生于絕經后的女性,但近幾年來的臨床統(tǒng)計資料表明,該病的發(fā)病率呈逐年升高趨勢。盡管早期子宮內膜癌經過規(guī)范治療之后,患者的5年生存率有了很大提高,但對于晚期、低分化子宮內膜癌或者特殊類型的子宮內膜癌患者來說,其預后往往較差,因此是造成患者死亡的重要因素之一。子宮內膜癌發(fā)病的臨床表現(xiàn)之一為不規(guī)則陰道流血,因此往往被誤認為是圍絕經期的月經紊亂,當患者去醫(yī)院就診時則為時已晚,因此耽誤了最佳的治療時機。子宮內膜癌的發(fā)生具有較為嚴格的演變過程,若在癌前病變前采取有效的干預措施,則可能降低該病的發(fā)病率。所以尋找能夠有效診斷和治療的分子標志物對于子宮內膜癌的治療具有十分重要的意義。卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是指生長在卵巢上的惡性腫瘤。由于卵巢位于盆腔深部,卵巢癌早期無典型癥狀,篩查的作用又極其有限,而且不具有特異性,因此卵巢癌的早期診斷比較困難。約有60%~70%的患者就診時已為晚期病例,即使目前腫瘤治療已經取得了突破性進展且新的治療手段也不斷出現(xiàn),但對于卵巢癌晚期病例治療的效果依然不理想,因此卵巢癌的死亡率居于婦科惡性腫瘤死亡率的首位。目前依然缺乏有效鑒別卵巢癌組織類型及良惡性的有效方法,無論在診斷和治療上對卵巢癌患者來說都是一大難題。miRNA屬于內源性單鏈非編碼單鏈小分子RNA,研究顯示多種miRNA與包括子宮內膜癌和卵巢癌在內的惡性腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展過程有關。miR-548屬于miRNA家族中的成員之一,目前已有研究顯示,miR-548c在乳腺癌、肝癌、骨肉瘤中呈低表達狀態(tài),因此具有類似抑癌基因的作用。但目前尚未有對于miR-548c在卵巢癌和子宮內膜癌中的作用以及相關機制的研究。轉移是造成子宮內膜癌和卵巢癌患者死亡的主要原因。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認為是子宮內膜癌和卵巢癌轉移的關鍵步驟,這增強了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力,進而促進其惡性化進展。因此,了解介導子宮內膜癌和卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT過程的分子機制可以確定未來治療這些癌癥的新分子靶點。Twist蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構(basic helix-loop-helix,b HLH)轉錄因子家族成員,為調控EMT的關鍵基因,能夠促進胚胎發(fā)育,通過促使中胚層上皮細胞向間質細胞轉化,從而使中胚層細胞具有遷移能力,最終對生物機體各個器官的生長發(fā)育產生促進作用。目前已有研究證實,Twist在子宮內膜癌和卵巢癌組織中均呈異常高表達狀態(tài),從而提示Twist在上述兩種惡性腫瘤中均具有促癌基因的作用�！灸康摹勘狙芯繖z測miR-548c和Twist在子宮內膜癌和卵巢癌中的表達水平,并分析兩者與上述兩種腫瘤臨床病理參數(shù)的關系。通過體外細胞實驗研究miR-548c對子宮內膜癌和卵巢癌細胞生物學行為的影響,并對其是否通過靶向調控Twist基因的表達影響子宮內膜癌和卵巢癌細胞侵襲和遷移進行探討。旨在明確miR-548c在子宮內膜癌和卵巢癌細胞惡性化進程中的具體作用機理,為尋找新的有效診斷、治療子宮內膜癌和卵巢癌的分子靶標奠定理論和實驗基礎�！痉椒ā�1.本研究采集50對原發(fā)性子宮內膜癌組織和癌旁相應正常組織,同時采集60例上皮型卵巢癌組織和20例正常上皮型卵巢組織,采用熒光定量PCR檢測上述組織樣本中miR-548c和Twist m RNA的表達,分析miR-548c與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的相關性,同時分析miR-548c與子宮內膜癌和卵巢癌患者預后的關系。2.將人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1A)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)均隨機分為2組,即Anti-Ctr組:將miRNA inhibitor control轉染細胞;Anti-548c組:將miR-548c inhibitor轉染細胞。檢測各組細胞的增殖活性、凋亡率、遷移能力和侵襲能力。3.采用生物學軟件預測miR-548c的靶基因,并通過熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證,檢測miR-548c表達上調和下調后對RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細胞中Twist蛋白表達的影響。檢測miR-548c表達上調和下調后對RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細胞中EMT相關基因E-cadherin、N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA表達的影響。分別將miR-548c inhibitor/miR-548c mimic和/或Twist si RNA/Twist c DNA轉染RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細胞,檢測上述細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力,檢測細胞中Twist蛋白的表達�！窘Y果】1.miR-548c在子宮內膜癌和卵巢癌組織中的表達水平顯著降低,Twist在子宮內膜癌和卵巢癌組織中的表達水平顯著增高相較于癌旁相應正常組織,miR-548c在子宮內膜癌組織中的表達水平顯著降低(P0.01)。相較于正常卵巢組織,miR-548c在卵巢癌組織中的表達水平顯著降低(P0.01)。在漿液性癌、III-IV期和3級腫瘤組織中miR-548c的表達顯著低于非漿液性、I-II期和1-2級腫瘤組織。與miR-548c高表達的子宮內膜癌患者相比,miR-548c低表達的子宮內膜癌患者的總體生存率較差。盡管在本研究使用TCGA數(shù)據(jù)進行Meta分析未能顯示出miR-548c表達水平與卵巢癌發(fā)生風險的關系(P=0.425),但miR-548c表達下調的卵巢癌患者的生存期較短。相較于癌旁相應正常組織,Twist m RNA在子宮內膜癌組織中的表達水平顯著增高(P0.01)。相較于正常卵巢組織,Twist m RNA在卵巢癌組織中的表達水平顯著增高(P0.01)。在漿液性癌、III-IV期和3級腫瘤組織中Twist m RNA的表達顯著高于非漿液性、I-II期和1-2級腫瘤組織。2.miR-548c能夠抑制細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯增高(P0.01),凋亡率明顯下降(P0.01);在OVCAR3細胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均顯著升高(P0.01),凋亡率明顯下降(P0.01);在HEC-1A細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯降低(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.01);在SKOV-3細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯降低(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.01)。3.Twist被確定為miR-548c的直接靶基因在RL95-2細胞中,當miR-548c表達水平抑制后,轉染Twist-WT質粒的細胞中熒光素酶的表達水平明顯升高(P0.01),而轉染Twist-Mut質粒的細胞中熒光素酶的表達水平則無明顯變化(P0.05)。在HEC-1A和SKOV-3細胞中,當miR-548c表達水平上調后,轉染Twist-WT質粒的細胞中熒光素酶的表達水平明顯降低(P0.01),而轉染Twist-Mut質粒的細胞中熒光素酶的表達水平則無明顯變化(P0.05)。在RL95-2細胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞中Twist蛋白的表達水平明顯增高(P0.01),E-cadherin m RNA的表達水平明顯降低(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA的表達水平則明顯升高(P0.01)。在HEC-1A和SKOV-3細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞中Twist蛋白的表達水平均明顯降低(P0.01),E-cadherin m RNA的表達水平明顯上升(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9m RNA的表達水平則顯著降低(P0.01)。在RL95-2細胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞的增殖活性明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組細胞的增殖活性顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的增殖活性明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細胞的增殖活性明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的增殖活性明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細胞的增殖活性無明顯變化(P0.05)。在RL95-2細胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組細胞的侵襲和遷移能力顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細胞的侵襲和遷移能力明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P0.05)。在RL95-2細胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細胞中Twist蛋白的表達水平明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組Twist蛋白的表達水平顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組Twist蛋白的表達水平明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組Twist蛋白的表達水平明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組Twist蛋白的表達水平明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組Twist蛋白的表達水平明顯增高(P0.05)�！窘Y論】1.miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌組織中的表達水平異常下調,且miR-548c表達下調與子宮內膜癌患者的不良預后有關。2.Twist在上述腫瘤組織中的表達水平異常上調。miR-548c和Twist均與卵巢癌的組織學類型、病例分級、臨床分期有關。3.miR-548c通過下調Twist的表達,進而抑制子宮內膜癌和卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移,誘導細胞凋亡,從而抑制子宮內膜癌和卵巢癌發(fā)生和發(fā)展。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.3
【圖文】：

糖凝膠電泳檢測總 RNA 質量整性是保障后續(xù)試驗順利進行的基礎，因此對各的檢測非常重要。本研究采取甲醛變性瓊脂糖凝膠進行測定。得到的結果如圖 1.1 所示，從圖中觀察泳結果圖中，這 3 條電泳條帶的大小依次由上至下8S、rRNA 5S 的大小相一致。同時，本研究通過超微總 RNA 純度進行檢測，檢測得到的結果顯示，所值未超過 2.0，均在 1.8~2.0 范圍內，具有較高純度究中提取的總 RNA 具有較好的完整性，能夠在下一試驗。

表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。由標本病理均為：子宮內膜樣腺癌，且均為 I 期患者，病理沒有探討 miR-548c 與子宮內膜癌患者的病理因素的關系中 miR-548c 的表達水平，本研究對 60 例卵巢癌組織以 miR-548c 的表達情況進行檢測（表 1.1）。熒光定量 PC正常卵巢組織，miR-548c 在卵巢癌組織中的表達水平顯學意義（P<0.01）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在漿液性癌、III-IiR-548c 的表達顯著低于非漿液性、I-II 期和 1-2 級腫瘤組果表明 miR-548c 表達下調可能在子宮內膜癌和卵巢癌的

【參考文獻】

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本文編號：2723840