【摘要】：【背景】子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)為女性重要惡性腫瘤之一,約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤的20-30%。子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生于絕經(jīng)后的女性,但近幾年來(lái)的臨床統(tǒng)計(jì)資料表明,該病的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。盡管早期子宮內(nèi)膜癌經(jīng)過(guò)規(guī)范治療之后,患者的5年生存率有了很大提高,但對(duì)于晚期、低分化子宮內(nèi)膜癌或者特殊類型的子宮內(nèi)膜癌患者來(lái)說(shuō),其預(yù)后往往較差,因此是造成患者死亡的重要因素之一。子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的臨床表現(xiàn)之一為不規(guī)則陰道流血,因此往往被誤認(rèn)為是圍絕經(jīng)期的月經(jīng)紊亂,當(dāng)患者去醫(yī)院就診時(shí)則為時(shí)已晚,因此耽誤了最佳的治療時(shí)機(jī)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生具有較為嚴(yán)格的演變過(guò)程,若在癌前病變前采取有效的干預(yù)措施,則可能降低該病的發(fā)病率。所以尋找能夠有效診斷和治療的分子標(biāo)志物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的治療具有十分重要的意義。卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是指生長(zhǎng)在卵巢上的惡性腫瘤。由于卵巢位于盆腔深部,卵巢癌早期無(wú)典型癥狀,篩查的作用又極其有限,而且不具有特異性,因此卵巢癌的早期診斷比較困難。約有60%~70%的患者就診時(shí)已為晚期病例,即使目前腫瘤治療已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展且新的治療手段也不斷出現(xiàn),但對(duì)于卵巢癌晚期病例治療的效果依然不理想,因此卵巢癌的死亡率居于婦科惡性腫瘤死亡率的首位。目前依然缺乏有效鑒別卵巢癌組織類型及良惡性的有效方法,無(wú)論在診斷和治療上對(duì)卵巢癌患者來(lái)說(shuō)都是一大難題。miRNA屬于內(nèi)源性單鏈非編碼單鏈小分子RNA,研究顯示多種miRNA與包括子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程有關(guān)。miR-548屬于miRNA家族中的成員之一,目前已有研究顯示,miR-548c在乳腺癌、肝癌、骨肉瘤中呈低表達(dá)狀態(tài),因此具有類似抑癌基因的作用。但目前尚未有對(duì)于miR-548c在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中的作用以及相關(guān)機(jī)制的研究。轉(zhuǎn)移是造成子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者死亡的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,這增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,進(jìn)而促進(jìn)其惡性化進(jìn)展。因此,了解介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT過(guò)程的分子機(jī)制可以確定未來(lái)治療這些癌癥的新分子靶點(diǎn)。Twist蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(basic helix-loop-helix,b HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,為調(diào)控EMT的關(guān)鍵基因,能夠促進(jìn)胚胎發(fā)育,通過(guò)促使中胚層上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而使中胚層細(xì)胞具有遷移能力,最終對(duì)生物機(jī)體各個(gè)器官的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)作用。目前已有研究證實(shí),Twist在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌組織中均呈異常高表達(dá)狀態(tài),從而提示Twist在上述兩種惡性腫瘤中均具有促癌基因的作用�！灸康摹勘狙芯繖z測(cè)miR-548c和Twist在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中的表達(dá)水平,并分析兩者與上述兩種腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究miR-548c對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并對(duì)其是否通過(guò)靶向調(diào)控Twist基因的表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移進(jìn)行探討。旨在明確miR-548c在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞惡性化進(jìn)程中的具體作用機(jī)理,為尋找新的有效診斷、治療子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的分子靶標(biāo)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)�！痉椒ā�1.本研究采集50對(duì)原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁相應(yīng)正常組織,同時(shí)采集60例上皮型卵巢癌組織和20例正常上皮型卵巢組織,采用熒光定量PCR檢測(cè)上述組織樣本中miR-548c和Twist m RNA的表達(dá),分析miR-548c與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,同時(shí)分析miR-548c與子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。2.將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1A)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)均隨機(jī)分為2組,即Anti-Ctr組:將miRNA inhibitor control轉(zhuǎn)染細(xì)胞;Anti-548c組:將miR-548c inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞。檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性、凋亡率、遷移能力和侵襲能力。3.采用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-548c的靶基因,并通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證,檢測(cè)miR-548c表達(dá)上調(diào)和下調(diào)后對(duì)RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細(xì)胞中Twist蛋白表達(dá)的影響。檢測(cè)miR-548c表達(dá)上調(diào)和下調(diào)后對(duì)RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細(xì)胞中EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA表達(dá)的影響。分別將miR-548c inhibitor/miR-548c mimic和/或Twist si RNA/Twist c DNA轉(zhuǎn)染RL95-2、HEC-1A和SKOV-3細(xì)胞,檢測(cè)上述細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力,檢測(cè)細(xì)胞中Twist蛋白的表達(dá)。【結(jié)果】1.miR-548c在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著降低,Twist在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著增高相較于癌旁相應(yīng)正常組織,miR-548c在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。相較于正常卵巢組織,miR-548c在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。在漿液性癌、III-IV期和3級(jí)腫瘤組織中miR-548c的表達(dá)顯著低于非漿液性、I-II期和1-2級(jí)腫瘤組織。與miR-548c高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者相比,miR-548c低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者的總體生存率較差。盡管在本研究使用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析未能顯示出miR-548c表達(dá)水平與卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系(P=0.425),但miR-548c表達(dá)下調(diào)的卵巢癌患者的生存期較短。相較于癌旁相應(yīng)正常組織,Twist m RNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著增高(P0.01)。相較于正常卵巢組織,Twist m RNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著增高(P0.01)。在漿液性癌、III-IV期和3級(jí)腫瘤組織中Twist m RNA的表達(dá)顯著高于非漿液性、I-II期和1-2級(jí)腫瘤組織。2.miR-548c能夠抑制細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯增高(P0.01),凋亡率明顯下降(P0.01);在OVCAR3細(xì)胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均顯著升高(P0.01),凋亡率明顯下降(P0.01);在HEC-1A細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯降低(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.01);在SKOV-3細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的增殖活性、侵襲和遷移能力均明顯降低(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.01)。3.Twist被確定為miR-548c的直接靶基因在RL95-2細(xì)胞中,當(dāng)miR-548c表達(dá)水平抑制后,轉(zhuǎn)染Twist-WT質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平明顯升高(P0.01),而轉(zhuǎn)染Twist-Mut質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化(P0.05)。在HEC-1A和SKOV-3細(xì)胞中,當(dāng)miR-548c表達(dá)水平上調(diào)后,轉(zhuǎn)染Twist-WT質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平明顯降低(P0.01),而轉(zhuǎn)染Twist-Mut質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化(P0.05)。在RL95-2細(xì)胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞中Twist蛋白的表達(dá)水平明顯增高(P0.01),E-cadherin m RNA的表達(dá)水平明顯降低(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA的表達(dá)水平則明顯升高(P0.01)。在HEC-1A和SKOV-3細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞中Twist蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P0.01),E-cadherin m RNA的表達(dá)水平明顯上升(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9m RNA的表達(dá)水平則顯著降低(P0.01)。在RL95-2細(xì)胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞的增殖活性明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組細(xì)胞的增殖活性顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細(xì)胞的增殖活性明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯變化(P0.05)。在RL95-2細(xì)胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P0.05)。在RL95-2細(xì)胞中,與Anti-Ctr組相比,Anti-548c組細(xì)胞中Twist蛋白的表達(dá)水平明顯增高(P0.01);與Anti-548c組相比,Anti-548c+Twist si RNA組Twist蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。在HEC-1A細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組Twist蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組Twist蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P0.01)。在SKOV-3細(xì)胞中,與Pre-Ctr組相比,Pre-548c組Twist蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P0.01);與Pre-548c組相比,Pre-548c+Twist c DNA組Twist蛋白的表達(dá)水平明顯增高(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌組織中的表達(dá)水平異常下調(diào),且miR-548c表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。2.Twist在上述腫瘤組織中的表達(dá)水平異常上調(diào)。miR-548c和Twist均與卵巢癌的組織學(xué)類型、病例分級(jí)、臨床分期有關(guān)。3.miR-548c通過(guò)下調(diào)Twist的表達(dá),進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌發(fā)生和發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.3
【圖文】：

糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 質(zhì)量整性是保障后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，因此對(duì)各的檢測(cè)非常重要。本研究采取甲醛變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行測(cè)定。得到的結(jié)果如圖 1.1 所示，從圖中觀察泳結(jié)果圖中，這 3 條電泳條帶的大小依次由上至下8S、rRNA 5S 的大小相一致。同時(shí)，本研究通過(guò)超微總 RNA 純度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)得到的結(jié)果顯示，所值未超過(guò) 2.0，均在 1.8~2.0 范圍內(nèi)，具有較高純度究中提取的總 RNA 具有較好的完整性，能夠在下一試驗(yàn)。

表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由標(biāo)本病理均為：子宮內(nèi)膜樣腺癌，且均為 I 期患者，病理沒(méi)有探討 miR-548c 與子宮內(nèi)膜癌患者的病理因素的關(guān)系中 miR-548c 的表達(dá)水平，本研究對(duì) 60 例卵巢癌組織以 miR-548c 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)（表 1.1）。熒光定量 PC正常卵巢組織，miR-548c 在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在漿液性癌、III-IiR-548c 的表達(dá)顯著低于非漿液性、I-II 期和 1-2 級(jí)腫瘤組果表明 miR-548c 表達(dá)下調(diào)可能在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的

【參考文獻(xiàn)】

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1 張國(guó)楠;黃建鳴;;卵巢上皮癌分子分型和化療耐藥的再認(rèn)識(shí)[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2017年06期

2 張雅;劉曉紅;李艷川;白潤(rùn)芳;楊春榮;;血清IL-6、miR-17-5p水平與卵巢癌患者化療后生存期的相關(guān)性分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年28期

3 Qiang Wu;Ren-Lian Lu;Jing-Xiang Li;Li-Jun Rong;;MiR-200a and miR-200b target PTEN to regulate the endometrial cancer cell growth in vitro[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年05期

4 嚴(yán)慧;劉斌;劉清;馬濤;王寧菊;;Twist介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與胃癌干樣細(xì)胞的形成及其相關(guān)機(jī)制的研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2017年02期

5 賀波;鄭t山;姜建青;俞永康;鄭軼峰;李衛(wèi);楊列;梁瑜;;轉(zhuǎn)錄因子twist在食管癌中表達(dá)的意義[J];西南國(guó)防醫(yī)藥;2016年12期

6 宋成;張婷;許耀輝;項(xiàng)達(dá)軍;陳道楨;;新型分子標(biāo)志物miR-320在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];中國(guó)婦幼保健;2016年02期

7 楊麗娜;趙靜;吳娟;李郁;楊紅;;Twist1調(diào)控FoxM1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年08期

8 馮振中;武世伍;俞嵐;蔡兆根;李楠;呂秀紅;陳嘉薇;;Twist1、VE-cadherin和血管生成擬態(tài)在子宮內(nèi)膜樣腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及意義[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2014年05期

9 李甫鑰;薛紀(jì)森;黃亦波;陳慧君;鄭飛云;;miR-34c對(duì)Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響[J];溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

10 侯冷晨;孔祥杰;李佳;張俊峰;李曉宇;房林;;miR-548c-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的影響[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

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1 張琳琳;吳志浩;尤嘉琮;李洋;劉彬;祖玲玲;李雪冰;常銳;周清華;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在尼古丁誘導(dǎo)肺癌吉非替尼獲得性耐藥中的作用及分子機(jī)制[A];第13屆全國(guó)肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

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1 宋偉;PARP抑制劑上調(diào)miR-664b-5p表達(dá)增加BRCA1突變?nèi)幮匀橄侔⿲?duì)化療的敏感性[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

2 羅展鵬;miR-548c-3p在骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用和分子機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2723840