發(fā)布時間：2020-06-19 12:25

【摘要】：目的:POU結構域5類轉錄因子1B(POU5F1B,POU domain class 5transcription factor 1B)基因,也稱OCT4-pg1、OTF3C、OTF3P1和POU5F1P1,是干細胞基因POU轉錄因子OCT4的假基因之一。本實驗研究假基因POU5F1B對宮頸癌(cervical cancer,CC)細胞生物學行為的影響并探索其潛在的作用機制。方法:(1)收集50例宮頸癌手術患者的新鮮癌組織及其配對的癌旁宮頸組織,采用定時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測宮頸組織中假基因POU5F1B的表達水平,并同時檢測在宮頸上皮永生化細胞(End1/e6e7細胞)、宮頸癌細胞株(CaSKi,SiHa,C33A和HeLa細胞)中假基因POU5F1B的表達水平。(2)構建POU5F1B下調(diào)的CaSKi細胞株,應用qRT-PCR法在mRNA水平測定假基因POU5F1B轉染宮頸癌細胞后的表達情況。(3)將人宮頸癌CaSKi細胞分為兩組,一組為轉染POU5F1B特異性小干擾RNA組(sh-POU5F1B組),一組為陰性對照序列組(sh-NC組)兩組細胞,分別采用CCK-8實驗、平板克隆形成實驗和EDU實驗以及細胞生存實驗,觀察下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞增殖能力的影響;采用Transwell小室細胞侵襲實驗檢測下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞侵襲能力的影響;利用細胞劃痕實驗檢測下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞遷移能力的影響;利用細胞耐藥實驗檢測下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞對化療藥順鉑敏感性的影響;利用細胞周期實驗檢測下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞的細胞周期的影響;利用AnnexinV/PI流式細胞凋亡實驗、Hoechst33258細胞核染色實驗檢測下調(diào)假基因POU5F1B對宮頸癌細胞凋亡的影響;采用蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot實驗檢測宮頸癌細胞中下調(diào)假基因POU5F1B的表達對其親本基因OCT4蛋白相對表達量的影響。(4)通過動物實驗觀察下調(diào)POU5F1B的宮頸癌細胞在裸鼠體內(nèi)移殖瘤的生長變化;最后通過免疫組化實驗測定移殖瘤中的OCT4的表達情況。結果:(1)與對照組癌旁宮頸組織相比,假基因POU5F1B在宮頸癌組織中高表達(P0.001);(2)與正常宮頸上皮永生化細胞End1/e6e7細胞相比,CaSKi、SiHa和C33A細胞中假基因POU5F1B均高表達(P均0.01),且在宮頸癌CaSKi細胞中的表達最高,轉染后的sh-POU5F1B組和sh-NC組兩組細胞中,sh-POU5F1B組CaSKi細胞的POU5F1B的表達量明顯低于對照組(P0.01);(3)sh-POU5F1B組CaSKi細胞增殖能力及生長速度明顯低于對照組(P0.001);(4)克隆形成實驗中,實驗組所形成的克隆數(shù)量更少大小更小,兩組比較P0.01;(5)EDU增殖實驗中,實驗組細胞中處于增殖分裂期的細胞比例低于對照組(P0.01);(6)sh-POU5F1B組CaSKi細胞的遷移能力明顯低于sh-NC組(P0.01);在48h時對照組細胞劃痕已基本愈合,而sh-POU5F1B組CaSKi細胞劃痕尚未愈合。(7)sh-POU5F1B組CaSKi細胞侵襲能力明顯低于對照組(P0.001);(8)與對照組相比,sh-POU5F1B組CaSKi細胞的細胞周期阻滯于G0-G1期(P0.01);(9)sh-POU5F1B組CaSKi細胞的凋亡率明顯高于對照組(P0.01);(10)與對照組細胞相比,sh-POU5F1B組CaSKi細胞在相同濃度梯度下,實驗組細胞的細胞抑制率明顯升高,sh-POU5F1B組細胞的半抑制濃度(IC50)低于對照組(P0.001),即對化療藥順鉑的敏感性高于對照組;(11)與對照組裸鼠相比,sh-POU5F1B組裸鼠體外移殖瘤的腫瘤組織質(zhì)量低于對照組(P0.001);(12)下調(diào)假基因POU5F1B后其親本基因OCT4蛋白的表達水平下降(P0.001)。結論:假基因POU5F1B在宮頸癌組織中高表達,下調(diào)假基因POU5F1B可抑制宮頸癌CaSKi細胞增殖、集落形成、遷移以及侵襲能力,阻滯細胞周期,增加宮頸癌CaSKi細胞對化療藥順鉑的敏感性,并具有促進宮頸癌細胞凋亡的作用。下調(diào)假基因POU5F1B抑制裸鼠體內(nèi)移殖瘤的進展。假基因POU5F1B通過捕獲靶向OCT4的miRNA來調(diào)節(jié)OCT4的表達,從而促進腫瘤的進展。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33
【圖文】：

三、實驗結果5F1B 在宮頸癌及癌旁組織中的表達水平 1 月至 2017 年 12 月泰興市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的及其宮頸癌癌旁組織，通過 qRT-PCR 方法檢測U5F1B mRNA 的表達量。結果顯示在 50 例宮頸達水平明顯高于其癌旁組織，且宮頸癌組織中假基旁組織的（2.55±0.27）倍，兩者比較，P<0.0011。該結果提示假基因 POU5F1B 可能在宮頸癌中

因 POU5F1B 在宮頸癌細胞中的表達情況。注：**表B-CaSKi 和 sh-NC-CaSKi 細胞的構建胞轉染小干擾POU5F1B shRNA質(zhì)粒表達載體后，接種至六孔板擴增，得到假基因 POU5F1即 sh-POU5F1B-CaSKi 細胞），按同樣方法篩SKi 細胞）。轉染 sh-POU5F1B-CaSKi 和 sh-N帶紅色熒光蛋白，若在電鏡下則細胞發(fā)出明顯OU5F1B shRNA 質(zhì)粒是已成功轉染入細胞中，因此我們可在電鏡下觀察在紅色熒光激發(fā)下 率 ， 如 圖 3B, D 顯 示 電 鏡 紅 色 熒 光SKi 細胞和對照組 sh-NC-CaSKi 細胞的細胞

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本文編號：2720787