【摘要】：目的:POU結(jié)構(gòu)域5類轉(zhuǎn)錄因子1B(POU5F1B,POU domain class 5transcription factor 1B)基因,也稱OCT4-pg1、OTF3C、OTF3P1和POU5F1P1,是干細(xì)胞基因POU轉(zhuǎn)錄因子OCT4的假基因之一。本實(shí)驗(yàn)研究假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌(cervical cancer,CC)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并探索其潛在的作用機(jī)制。方法:(1)收集50例宮頸癌手術(shù)患者的新鮮癌組織及其配對(duì)的癌旁宮頸組織,采用定時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)宮頸組織中假基因POU5F1B的表達(dá)水平,并同時(shí)檢測(cè)在宮頸上皮永生化細(xì)胞(End1/e6e7細(xì)胞)、宮頸癌細(xì)胞株(CaSKi,SiHa,C33A和HeLa細(xì)胞)中假基因POU5F1B的表達(dá)水平。(2)構(gòu)建POU5F1B下調(diào)的CaSKi細(xì)胞株,應(yīng)用qRT-PCR法在mRNA水平測(cè)定假基因POU5F1B轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞后的表達(dá)情況。(3)將人宮頸癌CaSKi細(xì)胞分為兩組,一組為轉(zhuǎn)染POU5F1B特異性小干擾RNA組(sh-POU5F1B組),一組為陰性對(duì)照序列組(sh-NC組)兩組細(xì)胞,分別采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和EDU實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞生存實(shí)驗(yàn),觀察下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響;采用Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響;利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響;利用細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥順鉑敏感性的影響;利用細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響;利用AnnexinV/PI流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)假基因POU5F1B對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響;采用蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))即Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)假基因POU5F1B的表達(dá)對(duì)其親本基因OCT4蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響。(4)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)POU5F1B的宮頸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)移殖瘤的生長(zhǎng)變化;最后通過免疫組化實(shí)驗(yàn)測(cè)定移殖瘤中的OCT4的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)與對(duì)照組癌旁宮頸組織相比,假基因POU5F1B在宮頸癌組織中高表達(dá)(P0.001);(2)與正常宮頸上皮永生化細(xì)胞End1/e6e7細(xì)胞相比,CaSKi、SiHa和C33A細(xì)胞中假基因POU5F1B均高表達(dá)(P均0.01),且在宮頸癌CaSKi細(xì)胞中的表達(dá)最高,轉(zhuǎn)染后的sh-POU5F1B組和sh-NC組兩組細(xì)胞中,sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞的POU5F1B的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P0.01);(3)sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞增殖能力及生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組(P0.001);(4)克隆形成實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組所形成的克隆數(shù)量更少大小更小,兩組比較P0.01;(5)EDU增殖實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中處于增殖分裂期的細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P0.01);(6)sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞的遷移能力明顯低于sh-NC組(P0.01);在48h時(shí)對(duì)照組細(xì)胞劃痕已基本愈合,而sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞劃痕尚未愈合。(7)sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞侵襲能力明顯低于對(duì)照組(P0.001);(8)與對(duì)照組相比,sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期(P0.01);(9)sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(P0.01);(10)與對(duì)照組細(xì)胞相比,sh-POU5F1B組CaSKi細(xì)胞在相同濃度梯度下,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞抑制率明顯升高,sh-POU5F1B組細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)低于對(duì)照組(P0.001),即對(duì)化療藥順鉑的敏感性高于對(duì)照組;(11)與對(duì)照組裸鼠相比,sh-POU5F1B組裸鼠體外移殖瘤的腫瘤組織質(zhì)量低于對(duì)照組(P0.001);(12)下調(diào)假基因POU5F1B后其親本基因OCT4蛋白的表達(dá)水平下降(P0.001)。結(jié)論:假基因POU5F1B在宮頸癌組織中高表達(dá),下調(diào)假基因POU5F1B可抑制宮頸癌CaSKi細(xì)胞增殖、集落形成、遷移以及侵襲能力,阻滯細(xì)胞周期,增加宮頸癌CaSKi細(xì)胞對(duì)化療藥順鉑的敏感性,并具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。下調(diào)假基因POU5F1B抑制裸鼠體內(nèi)移殖瘤的進(jìn)展。假基因POU5F1B通過捕獲靶向OCT4的miRNA來調(diào)節(jié)OCT4的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5F1B 在宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平 1 月至 2017 年 12 月泰興市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的及其宮頸癌癌旁組織，通過 qRT-PCR 方法檢測(cè)U5F1B mRNA 的表達(dá)量。結(jié)果顯示在 50 例宮頸達(dá)水平明顯高于其癌旁組織，且宮頸癌組織中假基旁組織的（2.55±0.27）倍，兩者比較，P<0.0011。該結(jié)果提示假基因 POU5F1B 可能在宮頸癌中

因 POU5F1B 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。注：**表B-CaSKi 和 sh-NC-CaSKi 細(xì)胞的構(gòu)建胞轉(zhuǎn)染小干擾POU5F1B shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體后，接種至六孔板擴(kuò)增，得到假基因 POU5F1即 sh-POU5F1B-CaSKi 細(xì)胞），按同樣方法篩SKi 細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染 sh-POU5F1B-CaSKi 和 sh-N帶紅色熒光蛋白，若在電鏡下則細(xì)胞發(fā)出明顯OU5F1B shRNA 質(zhì)粒是已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，因此我們可在電鏡下觀察在紅色熒光激發(fā)下 率 ， 如 圖 3B, D 顯 示 電 鏡 紅 色 熒 光SKi 細(xì)胞和對(duì)照組 sh-NC-CaSKi 細(xì)胞的細(xì)胞

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本文編號(hào)：2720787