【摘要】：子宮內膜癌(Endometrial cancer,EC)是女性生殖道三大惡性腫瘤之一,是發(fā)達國家最常見的婦科惡性腫瘤,也是發(fā)展中國家第二常見的婦科惡性腫瘤。在美國,每年有超過6萬個新診斷病例和1萬多個死亡病例。子宮內膜癌的發(fā)病率有增無減,且趨于年輕化,嚴重威脅女性的生活質量和生命。雖然子宮內膜癌在早期階段可通過手術使患者的生存率有所提高,然而,對于轉移或復發(fā)的患者而言,手術、化療和放療均難以達到滿意的治療效果。因此,尋找有效的治療靶點對子宮內膜癌的臨床治療具有重要意義。大量研究證實,甲殼質酶蛋白40(Chitinase-3-like Protein 1,YKL-40)在多種惡性腫瘤組織和血清中高表達,且與患者短生存期和不良預后密切相關,在腫瘤的早期診斷、治療和判斷預后中具有潛在價值。為探究子宮內膜癌的關鍵靶點,本課題組前期研究發(fā)現,YKL-40在子宮內膜癌患者組織和血清中均呈高表達,且血清YKL-40具有監(jiān)測病情和判斷預后的價值。YKL-40在子宮內膜癌多種細胞株(HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952)中高表達,其中,YKL-40在HEC-1A細胞株中的相對表達量最高,因此選擇HEC-1A細胞株作為我們后續(xù)研究的細胞模型。采用siRNA技術沉默YKL-40基因能夠抑制HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲及抗凋亡能力。本研究是在前期研究的基礎上,通過體內外實驗初步探討siRNA沉默YKL-40基因對HEC-1A細胞血管形成和凋亡信號通路關鍵蛋白的影響,旨在為子宮內膜癌的臨床治療和靶向藥物研究提供前期理論基礎。第一章YKL-40基因沉默對人子宮內膜癌細胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2、PI3K/AKT信號通路相關蛋白的影響目的在本課題組前期研究的基礎上建立穩(wěn)定沉默YKL-40基因的人子宮內膜癌HEC-1A細胞系,探討siRNA沉默YKL-40基因對HEC-1A細胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2和PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響。方法1、將本課題組前期構建的針對YKL-40基因的慢病毒載體siRNAYKL-40及陰性對照空載體siRNA-NC分別轉染至HEC-1A細胞。2、實驗分組:以穩(wěn)定轉染siRNA-YKL-40的HEC-1A細胞作為siRNA實驗組(si YKL-40);以轉染siRNA-NC的HEC-1A細胞作為空載體組(si NC);以未轉染的HEC-1A細胞作為空白對照組(Ctrl)。3、用實時熒光定量PCR(q PCR)和蛋白印跡法(western blotting)聯合檢測HEC-1A細胞沉默YKL-40基因后的沉默效果。4、用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)管腔形成實驗檢測YKL-40表達沉默對血管形成能力的影響。5、Western blotting檢測各組細胞中VEGF、VEGFR-2、p VEGFR-2(Tyr1175)、ERK1/2、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表達水平。6、使用不同濃度順鉑(cisplatin,DDP)(0,3.125,6.25,12.5,25,50和100mmol/L)處理HEC-1A細胞48h,用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測DDP對HEC-1A細胞生長活性的影響,并計算DDP對各組細胞的半數抑制濃度(IC50)。用DDP的IC50處理上述三組細胞,分4組:空白對照組(Ctrl);DDP+空白對照組(DDP+Ctrl);DDP+空載體組(DDP+si NC);DDP+siRNA實驗組(DDP+si YKL-40)。Western Blotting檢測以上4組細胞PI3K、p PI3K(Tyr458)、AKT、p AKT(Ser473)蛋白的表達水平。結果1、轉染96小時后,轉染成功的HEC-1A細胞表達綠色熒光蛋白(GFP),轉染效率超過85%,經嘌呤霉素篩選后,GFP穩(wěn)定表達,且傳代培養(yǎng)后轉染效率無明顯變化。2、檢測轉染后YKL-40基因的沉默效果:q PCR結果顯示,與空載體組(1.01±0.20)和空白對照組(1.12±0.44)相比,siRNA實驗組YKL-40m RNA的表達量(0.26±0.06)明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western Blotting結果顯示,siRNA實驗組中的YKL-40蛋白相對表達水平為1.52±0.16,明顯低于空載體組(6.21±0.10)和空白對照組(5.65±0.19),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、siRNA實驗組的成管數目為6.67±3.51個,明顯少于空白對照組和空載體組的成管數目(分別為33.67±10.96個、33±4個),差異有統(tǒng)計學意義(F=14.96,P=0.005)。4、與空載體組及空白對照組相比,siRNA實驗組的VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)的相對表達量下降(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。5、MTT結果顯示,經DDP處理后,各組細胞的生長活性均隨DDP濃度的增加而下降,而siRNA實驗組細胞的活性下降更為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經計算,DDP的IC50為30mmol/L。Western Blotting結果顯示,DDP+si YKL-40組的總AKT、p AKT(Ser473)和p PI3K(Tyr458)的表達水平均低于Ctrl、DDP+Ctrl及DDP+si NC組(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。結論1、成功建立穩(wěn)定沉默YKL-40基因的HEC-1A細胞系。2、siRNA沉默YKL-40基因后能夠顯著抑制體外血管形成能力。3、siRNA沉默YKL-40基因能夠下調HEC-1A細胞中VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表達。4、siRNA沉默YKL-40基因可能通過下調p PI3K(Tyr458)、AKT和p AKT(Ser473)蛋白的表達來增強HEC-1A細胞對DDP誘導細胞凋亡的敏感性。目的探討siRNA沉默YKL-40基因對HEC-1A細胞裸鼠移植瘤模型腫瘤的影響及其機制。方法1、將21只SPF級雌性BALB/c裸鼠隨機分為siRNA實驗組、空白對照組和空載體組,每組7只。將以上3組細胞(1×107/0.2ml/只)分別接種至裸鼠皮下。成瘤后,每隔3天測量裸鼠皮下腫瘤的長徑和短徑,并繪制腫瘤生長曲線。第5周以頸椎脫臼法處死各組裸鼠,測量離體腫瘤組織的大小、重量。2、用蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察3組裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學特征。3、免疫組化法和western blotting檢測移植瘤組織中YKL-40的表達。4、免疫組化法和western blotting檢測移植瘤組織中VEGF、EGFR的表達。結果1、siRNA實驗組成瘤時間為(9.29±1.50)天,明顯長于空白對照組和空載體組[分別為[(4.29±0.76)和(4.14±0.90)天]。siRNA實驗組移植瘤組織體積及重量均明顯小于空白對照組和空載體組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);而空白對照組與空載體組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組和空載體組相比,siRNA實驗組抑瘤率分別為78.67%、79.87%。2、HE染色顯微鏡下觀察發(fā)現,siRNA實驗組腫瘤細胞出現大片壞死,多見核固縮。而空載體組和空白對照組腫瘤細胞核大深染,可見核仁及核分裂,核固縮、壞死區(qū)域少。3、采用Image Pro Plus6.0軟件(IPP)分析免疫組化圖片,siRNA實驗組YKL-40蛋白的表達量明顯低于空白對照組和空載體組(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義。Western Blotting結果顯示,與空白對照組、空載體組相比,siRNA實驗組YKL-40的表達量明顯降低(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義。4、采用IPP分析免疫組化圖片,與空白對照組、空載體組相比,siRNA實驗組裸鼠腫瘤組織中的VEGF、EGFR的表達水平明顯下降(P0.01)。Western blotting結果顯示,與空白對照組、空載體組相比,siRNA實驗組裸鼠腫瘤組織中的VEGF、EGFR的表達水平均明顯下降(P0.01)。結論1、siRNA沉默YKL-40基因能夠抑制子宮內膜癌裸鼠移植瘤的生長。2、siRNA沉默YKL-40基因可能通過下調VEGF和EGFR蛋白的表達來抑制子宮內膜癌裸鼠移植瘤的生長。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33
【圖文】：

見圖 1-2。圖 1-1 倒置熒光顯微鏡下細胞轉染效率（20 ）A：明視野；B：熒光視野Fig 1-1 Transfection efficiency of HEC-1A cells under fluorescence microscope (20 )A: Bright field; B: Dark field

屆碩士學位論文 YKL-40 基因在子宮內膜癌血管形成和抗凋亡機制中果慢病毒載體 siRNA-YKL-40 轉染情況轉染 96 h 后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到轉染成功的 HEC-1A綠色熒光蛋白（GFP）。與明視野相比，熒光視野可見大量細胞表達效率超過 85%，且傳代培養(yǎng)后細胞狀態(tài)良好，轉染效率無明顯改 1-1。用 1 μg/mL 濃度的嘌呤霉素進行篩選，2 周后在倒置顯微鏡定轉染 siRNA-YKL-40 的 HEC-1A 細胞株，可見 GFP 穩(wěn)定表達-1A 細胞。見圖 1-2。

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本文編號：2719733