【摘要】：子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer,EC)是女性生殖道三大惡性腫瘤之一,是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的婦科惡性腫瘤,也是發(fā)展中國(guó)家第二常見的婦科惡性腫瘤。在美國(guó),每年有超過6萬個(gè)新診斷病例和1萬多個(gè)死亡病例。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率有增無減,且趨于年輕化,嚴(yán)重威脅女性的生活質(zhì)量和生命。雖然子宮內(nèi)膜癌在早期階段可通過手術(shù)使患者的生存率有所提高,然而,對(duì)于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者而言,手術(shù)、化療和放療均難以達(dá)到滿意的治療效果。因此,尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的臨床治療具有重要意義。大量研究證實(shí),甲殼質(zhì)酶蛋白40(Chitinase-3-like Protein 1,YKL-40)在多種惡性腫瘤組織和血清中高表達(dá),且與患者短生存期和不良預(yù)后密切相關(guān),在腫瘤的早期診斷、治療和判斷預(yù)后中具有潛在價(jià)值。為探究子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn),本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),YKL-40在子宮內(nèi)膜癌患者組織和血清中均呈高表達(dá),且血清YKL-40具有監(jiān)測(cè)病情和判斷預(yù)后的價(jià)值。YKL-40在子宮內(nèi)膜癌多種細(xì)胞株(HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952)中高表達(dá),其中,YKL-40在HEC-1A細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量最高,因此選擇HEC-1A細(xì)胞株作為我們后續(xù)研究的細(xì)胞模型。采用siRNA技術(shù)沉默YKL-40基因能夠抑制HEC-1A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及抗凋亡能力。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步探討siRNA沉默YKL-40基因?qū)EC-1A細(xì)胞血管形成和凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響,旨在為子宮內(nèi)膜癌的臨床治療和靶向藥物研究提供前期理論基礎(chǔ)。第一章YKL-40基因沉默對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2、PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響目的在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定沉默YKL-40基因的人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞系,探討siRNA沉默YKL-40基因?qū)EC-1A細(xì)胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法1、將本課題組前期構(gòu)建的針對(duì)YKL-40基因的慢病毒載體siRNAYKL-40及陰性對(duì)照空載體siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染至HEC-1A細(xì)胞。2、實(shí)驗(yàn)分組:以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-YKL-40的HEC-1A細(xì)胞作為siRNA實(shí)驗(yàn)組(si YKL-40);以轉(zhuǎn)染siRNA-NC的HEC-1A細(xì)胞作為空載體組(si NC);以未轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞作為空白對(duì)照組(Ctrl)。3、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q PCR)和蛋白印跡法(western blotting)聯(lián)合檢測(cè)HEC-1A細(xì)胞沉默YKL-40基因后的沉默效果。4、用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YKL-40表達(dá)沉默對(duì)血管形成能力的影響。5、Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中VEGF、VEGFR-2、p VEGFR-2(Tyr1175)、ERK1/2、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表達(dá)水平。6、使用不同濃度順鉑(cisplatin,DDP)(0,3.125,6.25,12.5,25,50和100mmol/L)處理HEC-1A細(xì)胞48h,用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)DDP對(duì)HEC-1A細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響,并計(jì)算DDP對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。用DDP的IC50處理上述三組細(xì)胞,分4組:空白對(duì)照組(Ctrl);DDP+空白對(duì)照組(DDP+Ctrl);DDP+空載體組(DDP+si NC);DDP+siRNA實(shí)驗(yàn)組(DDP+si YKL-40)。Western Blotting檢測(cè)以上4組細(xì)胞PI3K、p PI3K(Tyr458)、AKT、p AKT(Ser473)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1、轉(zhuǎn)染96小時(shí)后,轉(zhuǎn)染成功的HEC-1A細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP),轉(zhuǎn)染效率超過85%,經(jīng)嘌呤霉素篩選后,GFP穩(wěn)定表達(dá),且傳代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染效率無明顯變化。2、檢測(cè)轉(zhuǎn)染后YKL-40基因的沉默效果:q PCR結(jié)果顯示,與空載體組(1.01±0.20)和空白對(duì)照組(1.12±0.44)相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組YKL-40m RNA的表達(dá)量(0.26±0.06)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blotting結(jié)果顯示,siRNA實(shí)驗(yàn)組中的YKL-40蛋白相對(duì)表達(dá)水平為1.52±0.16,明顯低于空載體組(6.21±0.10)和空白對(duì)照組(5.65±0.19),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、siRNA實(shí)驗(yàn)組的成管數(shù)目為6.67±3.51個(gè),明顯少于空白對(duì)照組和空載體組的成管數(shù)目(分別為33.67±10.96個(gè)、33±4個(gè)),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.96,P=0.005)。4、與空載體組及空白對(duì)照組相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組的VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)的相對(duì)表達(dá)量下降(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、MTT結(jié)果顯示,經(jīng)DDP處理后,各組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性均隨DDP濃度的增加而下降,而siRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的活性下降更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)計(jì)算,DDP的IC50為30mmol/L。Western Blotting結(jié)果顯示,DDP+si YKL-40組的總AKT、p AKT(Ser473)和p PI3K(Tyr458)的表達(dá)水平均低于Ctrl、DDP+Ctrl及DDP+si NC組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1、成功建立穩(wěn)定沉默YKL-40基因的HEC-1A細(xì)胞系。2、siRNA沉默YKL-40基因后能夠顯著抑制體外血管形成能力。3、siRNA沉默YKL-40基因能夠下調(diào)HEC-1A細(xì)胞中VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表達(dá)。4、siRNA沉默YKL-40基因可能通過下調(diào)p PI3K(Tyr458)、AKT和p AKT(Ser473)蛋白的表達(dá)來增強(qiáng)HEC-1A細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。目的探討siRNA沉默YKL-40基因?qū)EC-1A細(xì)胞裸鼠移植瘤模型腫瘤的影響及其機(jī)制。方法1、將21只SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為siRNA實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和空載體組,每組7只。將以上3組細(xì)胞(1×107/0.2ml/只)分別接種至裸鼠皮下。成瘤后,每隔3天測(cè)量裸鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。第5周以頸椎脫臼法處死各組裸鼠,測(cè)量離體腫瘤組織的大小、重量。2、用蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察3組裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)特征。3、免疫組化法和western blotting檢測(cè)移植瘤組織中YKL-40的表達(dá)。4、免疫組化法和western blotting檢測(cè)移植瘤組織中VEGF、EGFR的表達(dá)。結(jié)果1、siRNA實(shí)驗(yàn)組成瘤時(shí)間為(9.29±1.50)天,明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組和空載體組[分別為[(4.29±0.76)和(4.14±0.90)天]。siRNA實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織體積及重量均明顯小于空白對(duì)照組和空載體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);而空白對(duì)照組與空載體組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組和空載體組相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組抑瘤率分別為78.67%、79.87%。2、HE染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),siRNA實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大片壞死,多見核固縮。而空載體組和空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞核大深染,可見核仁及核分裂,核固縮、壞死區(qū)域少。3、采用Image Pro Plus6.0軟件(IPP)分析免疫組化圖片,siRNA實(shí)驗(yàn)組YKL-40蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和空載體組(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blotting結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組、空載體組相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組YKL-40的表達(dá)量明顯降低(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、采用IPP分析免疫組化圖片,與空白對(duì)照組、空載體組相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織中的VEGF、EGFR的表達(dá)水平明顯下降(P0.01)。Western blotting結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組、空載體組相比,siRNA實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織中的VEGF、EGFR的表達(dá)水平均明顯下降(P0.01)。結(jié)論1、siRNA沉默YKL-40基因能夠抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。2、siRNA沉默YKL-40基因可能通過下調(diào)VEGF和EGFR蛋白的表達(dá)來抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

見圖 1-2。圖 1-1 倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（20 ）A：明視野；B：熒光視野Fig 1-1 Transfection efficiency of HEC-1A cells under fluorescence microscope (20 )A: Bright field; B: Dark field

屆碩士學(xué)位論文 YKL-40 基因在子宮內(nèi)膜癌血管形成和抗凋亡機(jī)制中果慢病毒載體 siRNA-YKL-40 轉(zhuǎn)染情況轉(zhuǎn)染 96 h 后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染成功的 HEC-1A綠色熒光蛋白（GFP）。與明視野相比，熒光視野可見大量細(xì)胞表達(dá)效率超過 85%，且傳代培養(yǎng)后細(xì)胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染效率無明顯改 1-1。用 1 μg/mL 濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，2 周后在倒置顯微鏡定轉(zhuǎn)染 siRNA-YKL-40 的 HEC-1A 細(xì)胞株，可見 GFP 穩(wěn)定表達(dá)-1A 細(xì)胞。見圖 1-2。

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本文編號(hào)：2719733