【摘要】：目的通過對多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)患者和非PCOS患者卵泡液中的環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)進(jìn)行測序,檢測卵泡液中circRNA的整體表達(dá)水平,根據(jù)PCOS組circRNA與對照組的表達(dá)差異,探尋circRNA可能參與PCOS疾病發(fā)生的功能通路和作用。方法收集2017年7月-2017年9月期間在江蘇省揚州市蘇北人民醫(yī)院生殖中心接受輔助生殖技術(shù)治療的女性不孕癥患者卵泡液,對所有患者臨床資料和基礎(chǔ)性激素、婦科超聲等檢查結(jié)果進(jìn)行對比分析。根據(jù)鹿特丹診斷規(guī)則挑選出PCOS組3例,并將單純男性因素來院治療的女性不孕癥患者卵泡液3例作為對照組。采用多步差速離心的方法分離出卵泡液樣本中的外泌體,對外泌體總RNA去線性提純,再隨機打斷成短片段,以這些片段構(gòu)建初步測序文庫,通過PCR擴增獲得最終測序文庫,對文庫測序并計算表達(dá)量。將測序結(jié)果與人類基因庫的參考基因組比對,并根據(jù)circRNA結(jié)構(gòu)特點鑒定,挑選出潛在的circRNA。最后將候選circRNA中外顯子的特征部分與己知基因進(jìn)行對比,將其注釋到該基因的功能類目中去。生物信息學(xué)分析主要利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)兩大數(shù)據(jù)庫,對鑒定出的circRNA的親本基因進(jìn)行富集。尋找PCOS組與對照組之間表達(dá)差異的circRNA,并對其親本基因的基因功能進(jìn)行GO注釋和富集,利用KEGG對親本基因的功能通路進(jìn)行富集。結(jié)果1.PCOS組與對照組間一般臨床資料的比較:PCOS組與對照組在年齡、不孕年限、身高體重指數(shù)(BMI)、促黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)和空腹血糖(FBG)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。PCOS患者的睪酮(TT)、血清催乳素(PRL)和抗苗勒管激素(AMH)水平較對照組有升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.PCOS組與對照組間CircRNA表達(dá)量水平的分析:2.1從PCOS組卵泡液獲得的有效片段總數(shù)約為6080萬,89.96%的有效序列可以成功比對至人類GRCH38基因組,對照組約為6460萬,86.64%可成功比對,兩組間沒有顯著性差異(P0.05)。其中PCOS組的反式剪接片段占2.68%,而對照組占1.11%,PCOS組獲得的有效片段中反向剪接片段數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。2.2六個卵泡液樣本中共鑒定出16771種circRNA和5308個親本基因。其中,PCOS組3個樣本中共鑒定出12907種circRNA及4311個親本基因,而非PCOS組共鑒定出5972種circRNA及3092個親本基因。2.3兩組樣本的circRNA表達(dá)量主要在10-1000TPM之間。兩組circRNA的長度主要分布在200-1000bp區(qū)間,大部分circRNA只含有1個外顯子,circRNA中外顯子含量增多,表達(dá)量顯著減少。2.4根據(jù)兩組間circRNA表達(dá)的差異倍數(shù)及P值顯著性進(jìn)行篩選,共篩選出412個差異表達(dá)circRNA,其中上調(diào)表達(dá)量的有167種,下調(diào)的有245種。PCOS組與對照組間差異circRNA的功能分析:3.1對差異circRNA的親本基因進(jìn)行GO功能富集(GO function enrich),主要在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)(cellular stress response)、細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death)、自噬調(diào)節(jié)(autophagy)、氧化磷酸化活性(oxidative phosphorylation activity)、病毒錨定(virion binding)等方面有較高程度的富集。3.2對差異circRNA的親本基因進(jìn)行KEGG功能富集(KEGG function enrich),主要在氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative phosphorylation)、谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、自噬調(diào)節(jié)(autophagy regulation)、在霍亂弧菌感染(Vibrio cholerae infection)、志賀氏菌病(Shigellosis)、沙門氏菌感染(Salmonella infection)、致病性大腸桿菌感染(pathogenic Escherichia coli infection)和上皮細(xì)胞的細(xì)菌入侵(bacterial invasion of epithelial cells)、同時在亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病等功能通路上有較高程度的富集。3.3根據(jù)circRNA表達(dá)差異倍數(shù)7、P0.001,且己知親本基因功能可能與PCOS相關(guān)等條件中,挑選 ciRNA-7323_TIAM1、ciRNA-2003_BECN1、ciRNA-1880_RHOA、ciRNA-10775_RUVBL1這4種差異表達(dá)的circRNA,預(yù)測該4個circRNA可能作為miRNA海綿與己發(fā)現(xiàn)的141種miRNA之間存在的161個相互作用。結(jié)論1.PCOS組患者的反式剪接過程在體內(nèi)更加活躍,circRNA表達(dá)的種類更多,表達(dá)量更豐富。2.多種circRNA在多囊卵巢綜合征患者卵泡液中呈異常表達(dá),差異circRNA可能通過細(xì)菌感染、氧化應(yīng)激、自噬、神經(jīng)系統(tǒng)病變等病理過程導(dǎo)致PCOS疾病的發(fā)生。3.ciRNA-7323_TIAM1、ciRNA-2003_BECN1、ciRNA-1880_RHOA、ciRNA-10775_RUVBL1這4種差異表達(dá)的circRNA可能作為進(jìn)一步研究PCOS發(fā)病相關(guān)機理的目標(biāo)靶點。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.75

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本文編號：2717705