【摘要】：妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病特指一組以胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞異常增殖及胎盤絨毛過度生長為主要特征的與妊娠異常相關(guān)的疾病,其中包括部分性葡萄胎和完全性葡萄胎以及由葡萄胎惡變轉(zhuǎn)化成的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。統(tǒng)計(jì)學(xué)表明,約有9~20%的葡萄胎會惡化為滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤,滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤與胚胎的遺傳基因相關(guān),是一種特殊的人類腫瘤疾病,包括侵襲性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框(Forkhead box,FOX)是調(diào)控哺乳動物細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及血管生成的關(guān)鍵因子。當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在肺癌、胰腺癌、胃癌和肝癌等實(shí)體腫瘤中表達(dá)量均存在不同程度的升高。在胚胎發(fā)育階段,FOXM1通過對多種下游因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控,促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S及G2/M的轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。FOXM1b可與血管內(nèi)皮生長因子的啟動子相結(jié)合,促進(jìn)腫瘤形成的遷移、侵襲及血管生成等過程。然而,轉(zhuǎn)錄因子FOX家族的FOXOs亞族則在類似的生物過程中表現(xiàn)出相反的表達(dá)水平及調(diào)控趨勢。例如:FOXO1和FOXO3在多種腫瘤中表達(dá)水平異常減少,并且當(dāng)其發(fā)生磷酸化時(shí)可以抑制細(xì)胞周期蛋白及VEGF的表達(dá)。有研究表明FOXOs家族與FOXM1具有一段共有的調(diào)控序列,因此在下游因子的調(diào)控中可產(chǎn)生競爭性抑制。由于FOXOs/FOXM1之間具有這種特殊關(guān)系,因此它成為了腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)鍵靶點(diǎn),如FOXM1抑制劑鹽霉素A、硫絲鏈菌肽等已被證實(shí)可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。一、目的本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)FOXM1可調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞JAR的增殖和遷移,而FOXM1與滋養(yǎng)細(xì)胞異常增殖所引起的葡萄胎是否具有相關(guān)性尚未見報(bào)道。本課題擬收集臨床葡萄胎、正常足月妊娠的胎盤及子宮內(nèi)膜,免疫組化法分析轉(zhuǎn)錄因子FOXM1、FOXOs等在葡萄胎、正常足月妊娠的不同時(shí)期胎盤及子宮內(nèi)表達(dá)情況;體外以人絨毛膜癌Be Wo、JAR細(xì)胞系檢測FOXM1表達(dá);通過重組FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒及si RNA-FOXM1干擾質(zhì)粒調(diào)控FOXM1表達(dá),而后對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2)及腫瘤侵襲相關(guān)蛋白(VEGF、MMPs)的表達(dá)進(jìn)行檢測,并研究其對人絨毛膜癌細(xì)胞JAR的增殖、遷移和侵襲能力的影響;通過檢測AKT,ERK信號通路變化,逐步明確FOXM1對葡萄胎增殖、遷移和侵襲能力的影響及分子機(jī)制。一、目的二、方法(一)分析轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在葡萄胎、足月胎盤和子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)1.收集臨床葡萄胎、足月胎盤和子宮內(nèi)膜組織樣本,石蠟包埋;2.利用免疫組化分析檢測葡萄胎、足月胎盤和子宮內(nèi)膜組織中FOXM1、FOXO1及FOXO3等表達(dá)情況;3.利用Western Blot、免疫熒光檢測分析FOXM1在人絨毛膜癌Be Wo、JAR細(xì)胞中的表達(dá)水平及細(xì)胞定位;4.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,將重組FOXM1的過表達(dá)質(zhì)粒及si RNA-FOXM1干擾質(zhì)粒導(dǎo)入至人絨毛膜癌細(xì)胞株JAR中,調(diào)節(jié)FOXM1的表達(dá)水平;5.通過CCK8法分析FOXM1表達(dá)的改變對JAR細(xì)胞生長增殖能力的影響;通過Western blot檢測人絨毛膜癌細(xì)胞JAR中FOXM1的表達(dá)水平以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2)的表達(dá)量的變化;6.通過Transwell檢測FOXM1表達(dá)改變對JAR細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響;通過Western blot檢測人絨毛膜癌細(xì)胞JAR中腫瘤侵襲相關(guān)蛋白(VEGF、MMPs)的表達(dá)量的變化;(二)AKT、ERK信號通路在葡萄胎中對轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的調(diào)控機(jī)制的研究1.收集臨床葡萄胎、足月胎盤和子宮內(nèi)膜組織樣本;2.通過免疫組化分析,檢測葡萄胎、足月胎盤和子宮內(nèi)膜組織中AKT、ERK等信號通路分子的表達(dá)情況;3.通過不同濃度AKT信號通路抑制劑LY294002對p-AKT進(jìn)行下調(diào)處理;不同濃度的ERK信號通路抑制劑U0126對p-ERK進(jìn)行下調(diào)處理。利用Western blot檢測兩抑制劑對人絨毛膜癌細(xì)胞JAR進(jìn)行加藥處理后,FOXM1的表達(dá)情況;4.利用Transwell實(shí)驗(yàn)分析AKT信號通路抑制劑LY294002和ERK信號通路抑制劑U0126對人絨毛膜癌細(xì)胞JAR侵襲和遷移能力的影響;通過CCK8檢測其對JAR細(xì)胞增殖能力的影響;5.通過Western blot檢測LY294002和U0126對FOXM1表達(dá)水平的影響及其對下游MMPs和VEGF的表達(dá)。三、結(jié)果(一)轉(zhuǎn)錄因子FOXM1、FOXO1及FOXO3與葡萄胎的增殖能力相關(guān)1.FOXM1在葡萄胎組織中表達(dá)最為顯著,主要表達(dá)在絨毛滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞體滋養(yǎng)層。FOXO1和FOXO3表達(dá)趨勢較FOXM1相反;2.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FOXM1在Be Wo細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于JAR細(xì)胞;免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,FOXM1在JAR細(xì)胞中,主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì),而在Be Wo細(xì)胞中,細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá);3.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,JAR細(xì)胞轉(zhuǎn)染FOXM1的過表達(dá)質(zhì)粒后,FOXM1的表達(dá)量升高;轉(zhuǎn)染FOXM1干擾質(zhì)粒后,FOXM1的表達(dá)量降低;4.轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2)及腫瘤侵襲相關(guān)蛋白(VEGF、MMPs)的表達(dá)變化;JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均獲得提高,FOXM1在JAR細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá);轉(zhuǎn)染FOXM1干擾質(zhì)粒后,JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均下降,FOXM1僅在JAR細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá);5.轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒,JAR細(xì)胞中MMPs,VEGF的表達(dá)量均明顯升高;轉(zhuǎn)染FOXM1干擾質(zhì)粒后,JAR細(xì)胞中MMPs,VEGF的表達(dá)量均明顯降低。(二)AKT、ERK信號通路在葡萄胎中對轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的調(diào)控機(jī)制的研究1.AKT、ERK在葡萄胎中表達(dá)水平最高,表達(dá)定位表明其在細(xì)胞滋養(yǎng)層、合胞體滋養(yǎng)層及絨毛滋養(yǎng)層的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá);2.AKT信號通路抑制劑LY294002和ERK信號通路抑制劑U0126在不同濃度下處理JAR細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其與FOXM1的表達(dá)水平相關(guān),且與藥物濃度呈劑量依賴性;3.AKT、ERK可通過調(diào)控FOXM1的表達(dá),影響JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移;4.AKT、ERK可通過調(diào)控FOXM1的表達(dá),影響JAR細(xì)胞中,MMPs和VEGF的表達(dá)。四、結(jié)論(一)轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在葡萄胎增殖機(jī)制1.FOXM1在葡萄胎內(nèi)有較高的表達(dá)并主要在絨毛滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和合胞體滋養(yǎng)層的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);2.FOXM1在人絨毛膜癌細(xì)胞中,調(diào)控細(xì)胞的增殖;3.FOXM1在人絨毛膜癌細(xì)胞中,調(diào)控細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;4.FOXM1在人絨毛膜癌細(xì)胞中,調(diào)控MMPs和VEGF的表達(dá)。(二)AKT、ERK信號通路在葡萄胎中對轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的調(diào)控機(jī)制1.AKT、ERK信號通路在葡萄胎中表達(dá),主要在絨毛滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和合胞體滋養(yǎng)層的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá);2.AKT、ERK可調(diào)控FOXM1的表達(dá),其信號通路抑制劑對FOXM1的調(diào)控呈劑量依賴性;3.AKT、ERK通過FOXM1調(diào)控JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;4.AKT、ERK通過FOXM1調(diào)控MMPs和VEGF的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 Fan-Di Meng;Ji-Chao Wei;Kai Qu;Zhi-Xin Wang;Qi-Fei Wu;Ming-Hui Tai;Hao-Chen Liu;Rui-Yao Zhang;Chang Liu;;FoxM1 overexpression promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2015年01期

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本文編號：2716940