【摘要】：胎盤是胎兒和母體間物質(zhì)交換的重要場所,而滋養(yǎng)細(xì)胞是其主要細(xì)胞類型,在胚胎植入和胎盤發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮螺旋動脈并分化為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞,引起子宮和胎盤血管的重塑。妊娠8~10孕周時,由于絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入底蛻膜在螺旋小動脈中聚集形成栓子導(dǎo)致母體血流量不足胎盤組織氧分壓較低,不超過20mmHg,隨后,滋養(yǎng)細(xì)胞栓子崩解母體血液進(jìn)入胎盤腔循環(huán),氧分壓上升到50~60mmHg。在此期間,氧濃度對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力起到至關(guān)重要的影響,研究表明,滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足引起螺旋動脈重鑄障礙導(dǎo)致多種妊娠疾病的發(fā)生,如流產(chǎn),死胎,子癇前期,胎兒宮內(nèi)受限等。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)是缺氧狀態(tài)下廣泛表達(dá)于人體和哺乳動物內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,激活后可以調(diào)節(jié)其下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,在維持及調(diào)控妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮的過程與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程相似,不同的是滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性受到嚴(yán)格的時空限制。同時,胎盤發(fā)育過程中滋養(yǎng)細(xì)胞與母體氧水平的相互作用是調(diào)節(jié)侵襲過程的重要因素。趨化因子受體4(Chemokine receptor 4,CXCR4)是由352個氨基酸組成的G蛋白偶聯(lián)受體,與其配體CXCL12結(jié)合后可使下游多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,調(diào)控妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移。研究表明,在缺氧的骨肉瘤細(xì)胞中,HIF-1α可以直接結(jié)合到CXCR4基因啟動子中的缺氧反應(yīng)元件上,從而上調(diào)CXCR4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。但缺氧條件下HIF-1α與CXCR4及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移能力的關(guān)系尚未見報道。目的本研究采用實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、Transwell實驗和劃痕實驗,檢測人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞在缺氧條件下HIF-1α、CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)及細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變,初步探討HIF-1α在缺氧條件下對滋養(yǎng)細(xì)胞CXCR4的表達(dá)及細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。材料和方法1研究對象人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞購自北京鼎國昌盛生物科技公司,使用RPMI1640、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO_2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行干預(yù)試驗。2方法本研究使用RPMI1640完全培養(yǎng)基將JEG-3細(xì)胞懸浮后,置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長至對數(shù)期時用胰酶進(jìn)行消化,接種于培養(yǎng)瓶或六孔板,然后將細(xì)胞繼續(xù)于恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%時,對細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的處理。2.1缺氧對JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4表達(dá)的影響采用終濃度為150μmol/L的氯化鈷(cobalt chloride,CoCl_2)分別作用JEG-3細(xì)胞12h、24h、48h建立細(xì)胞體外缺氧模型。將細(xì)胞分為常氧對照組、缺氧12h組、缺氧24h組和缺氧48h組。采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印跡實驗(Western Blot)分別檢測各組JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。2.2缺氧條件下沉默HIF-1α對JEG-3細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)和細(xì)胞侵襲遷移的影響將JEG-3細(xì)胞分為4組:常氧空白組(未加CoCl_2),缺氧空白組(經(jīng)CoCl_2缺氧處理),缺氧NC組(轉(zhuǎn)染HIF-1α陰性對照再經(jīng)CoCl_2缺氧處理),缺氧HIF-1αsiRNA組(轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA再經(jīng)CoCl_2缺氧處理),使用Real-time PCR和Western Blot分別檢測各組細(xì)胞HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平,Transwell實驗和劃痕實驗檢測各組細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。3統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以?x±s表示實驗定量資料數(shù)據(jù)。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以α=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1缺氧條件下JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA的表達(dá)Real-time PCR結(jié)果顯示,HIF-1αmRNA相對表達(dá)量在缺氧12h組(1.16±0.25),缺氧24h組(1.07±0.12)和缺氧48h組(1.05±0.17),與常氧對照組(1.03±0.15)相比無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CXCR4 mRNA相對表達(dá)量隨缺氧時間的延長逐漸增加,缺氧12h組(4.84±0.28)、缺氧24h組(7.12±0.65)、缺氧48h組(11.19±0.91)明顯高于常氧對照組(1.05±0.16),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2缺氧條件下JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)水平Western Blot結(jié)果顯示,HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)水平隨缺氧時間的延長均逐漸增加:缺氧12h組(0.66±0.06,0.60±0.04),缺氧24h組(0.91±0.04,0.84±0.07),缺氧48h組(1.11±0.09,1.04±0.07)高于常氧對照組(0.26±0.07,0.38±0.16),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3缺氧條件下沉默HIF-1α后JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA的表達(dá)3.1缺氧條件下沉默HIF-1α后JEG-3細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)Real-time PCR結(jié)果顯示:缺氧HIF-1αsiRNA組的HIF-1αmRNA表達(dá)水平(0.23±0.08),明顯低于缺氧空白組(0.98±0.06),缺氧陰性轉(zhuǎn)染組(1.03±0.09)和常氧空白組(1.00±0.11),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2缺氧條件下沉默HIF-1α后JEG-3細(xì)胞中CXCR4 mRNA的表達(dá)缺氧HIF-1αsiRNA組CXCR4 mRNA的表達(dá)水平(0.44±0.08)明顯低于缺氧空白組(6.18±0.79),缺氧陰性轉(zhuǎn)染組(5.83±0.33)和常氧空白組(1.35±0.10),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧空白組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組的CXCR4 mRNA表達(dá)高于常氧空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4缺氧條件下沉默HIF-1α后JEG-3細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示,缺氧HIF-1αsiRNA組HIF-1α蛋白和CXCR4表達(dá)水平(0.13±0.05,0.30±0.03)均明顯低于缺氧空白組(0.88±0.09,0.96±0.06),缺氧陰性轉(zhuǎn)染組(0.82±0.11,0.87±0.07)和常氧空白組(0.29±0.08,0.44±0.07),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧空白組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組的HIF-1α和CXCR4蛋白表達(dá)水平高于常氧空白組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5缺氧條件下沉默HIF-1α后JEG-3細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化缺氧HIF-1αsiRNA組的細(xì)胞侵襲數(shù)量和劃痕寬度愈合率(34.93±8.01,25.08±4.73)均明顯低于缺氧空白組(88.40±5.81,74.63±4.90),缺氧陰性轉(zhuǎn)染組(82.67±4.28,70.22±3.05)和常氧空白組(46.53±4.70,43.89±4.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧空白組,缺氧陰性轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞侵襲數(shù)量和劃痕寬度愈合率均高于常氧空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論缺氧促進(jìn)HIF-1α和CXCR4的表達(dá),沉默HIF-1α可能通過CXCR4的下調(diào)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
【圖文】：

l-time PCR 結(jié) 果 顯 示 ,HIF-1α mRNA 相 對 表 達(dá) 量 在 缺 氧0.25），，缺氧 24h 組（1.07±0.12）和缺氧 48h 組（1.05±0.17），03±0.15）相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。CXC量隨缺氧時間的延長逐漸增加，缺氧 12h 組（4.84±0.28）、缺0.65）、缺氧 48h 組（11.19±0.91）明顯高于常氧對照組(1.05±0.學(xué)意義（P<0.05），見表 3.1，圖 3.1 和圖 3.2。表 3.1 缺氧條件下 JEG-3 細(xì)胞中 HIF-1α和 CXCR4 mRNA 的表達(dá)( x±s分組 HIF-1α CXCR4常氧對照組 1.03±0.15 1.05±0.16缺氧 12h 組 1.16±0.25 4.84±0.28a缺氧 24h 組 1.07±0.12 7.12±0.65a缺氧 48h 組 1.05±0.17 11.19±0.91F 0.29 159.45P 0.83 0.00a 表示與常氧對照組相比，P<0.05，b 表示與缺氧上一組相比 P<0.05。

圖 3.2 缺氧條件下 JEG-3 細(xì)胞中 CXCR4 mRNA 的表達(dá)：a 表示與常氧對照組相比，P<0.05，b 表示與缺氧上一組相比 P<0.05條件下 JEG-3 細(xì)胞中 HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表達(dá)stern Blot 結(jié)果顯示,HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表達(dá)水平隨缺氧時加：缺氧 12h 組（0.66±0.06，0.60±0.04），缺氧 24h 組（0.7），缺氧 48h 組（1.11±0.09，1.04±0.07）高于常氧對照組（0.6），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 3.2，圖 3.3。表 3.2 缺氧條件下 JEG-3 細(xì)胞中 HIF-1α和 CXCR4 蛋白的表達(dá)( x±分組 HIF-1α蛋白 CXCR4 蛋白常氧對照組 0.26±0.07 0.38±0.16缺氧 12h 組 0.66±0.06a0.60±0.04a缺氧 24h 組 0.91±0.04ab0.84±0.07ab缺氧 48h 組 1.11±0.09ab1.04±0.07ab
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭清;吳小華;呂英璞;楊波;徐峰;張少靜;;CXCL12-CXCR4趨化因子軸與卵巢上皮性癌關(guān)系的實驗研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2013年21期

本文編號：2711237