【摘要】：目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,有侵襲性強(qiáng)、遷移能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。近年來(lái)對(duì)維生素D非經(jīng)典作用的研究表明,活性維生素D(1a,25-dihydroxy-vitaminD_3,1α,25(OH)_2D_3)有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化的功能。但是,在課題組前期建立的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化模型中,長(zhǎng)期使用1α,25(OH)_2D_3處理后,隨著細(xì)胞惡性程度的增加我們發(fā)現(xiàn)1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的能力減弱了,而在這過(guò)程中CYP24A1基因異常升高數(shù)千倍。CYP24A1基因編碼的24-羥化酶是維生素D代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,它可以使1α,25(OH)_2D_3生成活性極低的代謝產(chǎn)物,從而維持血鈣濃度穩(wěn)定。CYP24A1在正常組織中的表達(dá)水平較低,然而有研究結(jié)果表明,腫瘤組織CYP24A1的表達(dá)增高,并且在1α,25(OH)_2D_3處理后其表達(dá)水平進(jìn)一步異常升高。為了研究誘導(dǎo)型CYP24A1是否拮抗了1α,25(OH)_2D_3的抗腫瘤效果,本研究建立了穩(wěn)定CYP24A1低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系,通過(guò)分析誘導(dǎo)型CYP24A1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,以及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療藥物敏感性的改變,初步探討誘導(dǎo)型CYP24A1對(duì)1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。同時(shí),利用基因芯片技術(shù)分析與誘導(dǎo)型CYP24A1共表達(dá)基因表達(dá)的變化情況,探究誘導(dǎo)型CYP24A1影響活性維生素D抗腫瘤的分子機(jī)制。為深入了解維生素D在腫瘤防治方面的應(yīng)用提供可靠研究資料。方法:本研究分為兩個(gè)部分,(1)誘導(dǎo)型CYP24A1對(duì)1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響:建立穩(wěn)定低表達(dá)和過(guò)表達(dá)CYP24A1的卵巢癌細(xì)胞系。平板克隆檢測(cè)1α,25(OH)_2D_3對(duì)不同CYP24A1表達(dá)水平的卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)1α,25(OH)_2D_3對(duì)不同CYP24A1表達(dá)水平的卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響。使用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,分析不同CYP24A1水平是否影響了卵巢癌細(xì)胞對(duì)1α,25(OH)_2D_3和卡鉑聯(lián)合作用的敏感性。(2)1α,25(OH)_2D_3誘導(dǎo)CYP24A1上調(diào)的相關(guān)基因表達(dá)譜分析:使用CYP24A1啟動(dòng)子序列改造熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),加入1α,25(OH)_2D_3處理因素,分析其對(duì)CYP24A1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)情況,并用qRT-PCR檢測(cè)1α,25(OH)_2D_3對(duì)卵巢癌細(xì)胞CYP24A1基因表達(dá)的影響。使用100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3處理SKOV-3細(xì)胞,利用基因芯片技術(shù),分析差異表達(dá)的基因以及其中與CYP24A1有共表達(dá)關(guān)系的基因,并實(shí)驗(yàn)qRT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。anti分析誘導(dǎo)型CYP24A1影響1α,25(OH)_2D_3抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的可能機(jī)制。結(jié)果:(1)減少CYP24A1的表達(dá)對(duì)1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響:通過(guò)基因水平和蛋白水平的驗(yàn)證,我們成功建立了CYP24A1基因穩(wěn)定低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的卵巢癌SKOV-3和OVCAR-8細(xì)胞系。在1α,25(OH)_2D_3處理后,CYP24A1基因敲低組細(xì)胞增殖能力顯著低于陰性對(duì)照組(p0.001),并且CYP24A1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力顯著高于陰性對(duì)照組(p0.05)。這說(shuō)明CYP24A1敲低后可以增強(qiáng)1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的作用,同時(shí)CYP24A1基因過(guò)表達(dá)后則表現(xiàn)出對(duì)1α,25(OH)_2D_3抑制增殖作用的抵抗。平板克隆結(jié)果表明,在SKOV-3細(xì)胞中,CYP24A1敲低組細(xì)胞的克隆形成能力顯著低于陰性對(duì)照組(p0.001),并且在陰性對(duì)照組中1α,25(OH)_2D_3使其克隆形成率下降了59.78%,而1α,25(OH)_2D_3使CYP24A1敲低組細(xì)胞的克隆形成率下降了76.82%。這說(shuō)明減少CYP24A1表達(dá)不僅可以降低卵巢癌細(xì)胞的增殖能力,還可以提高1α,25(OH)_2D_3對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組中1α,25(OH)_2D_3沒(méi)有顯著改變細(xì)胞遷移指數(shù),而在CYP24A1敲低組細(xì)胞中細(xì)胞遷移指數(shù)則顯著降低(p0.05)。并且在OVCAR-8細(xì)胞中,CYP24A1敲低組細(xì)胞的遷移指數(shù)也顯著低于陰性對(duì)照組(p0.05)。這說(shuō)明減少CYP24A1表達(dá)不僅可以降低卵巢癌細(xì)胞的遷移能力,還可以提高1α,25(OH)_2D_3對(duì)細(xì)胞遷移的抑制能力。(2)CYP24A1的表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞1α,25(OH)_2D_3聯(lián)合卡鉑處理敏感性的影響:CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1α,25(OH)_2D_3單獨(dú)處理卵巢癌細(xì)胞時(shí),從48小時(shí)開(kāi)始,細(xì)胞存活能力顯著下降,并且細(xì)胞活力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,呈時(shí)間依賴性(p0.05)。卡鉑單獨(dú)處理卵巢癌細(xì)胞時(shí),細(xì)胞活力隨卡鉑濃度的升高而下降,呈劑量依賴效應(yīng)(p0.001)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇低濃度卡鉑(20 mg/L)聯(lián)合1α,25(OH)_2D_3(100 nmol/L)處理48小時(shí),觀察聯(lián)合作用對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療藥物增敏的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3單獨(dú)處理、20 mg/L的卡鉑單獨(dú)處理以及聯(lián)合處理,均可以顯著降低細(xì)胞的存活能力(p0.001),并且1α,25(OH)_2D_3增強(qiáng)了卡鉑的抗增殖效果(p0.001),與80 mg/L的卡鉑單獨(dú)處理組的抑制作用相似。說(shuō)明1α,25(OH)_2D_3可以顯著提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性,我們還觀察到CYP24A1敲低組細(xì)胞還可以進(jìn)一步降低聯(lián)合作用的細(xì)胞存活能力。(3)1α,25(OH)_2D_3對(duì)CYP24A1啟動(dòng)子活性的影響:熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1-100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3處理可以顯著提高SKOV-3細(xì)胞CYP24A1啟動(dòng)子的活性;100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3處理SKOV-3細(xì)胞12小時(shí)后可以顯著提高CYP24A1啟動(dòng)子活性。這說(shuō)明CYP24A1啟動(dòng)子活性的提高主要與1α,25(OH)_2D_3處理時(shí)間有關(guān),與1α,25(OH)_2D_3的濃度關(guān)系不大。在CYP24A1基因敲低后,使用1α,25(OH)_2D_3處理后CYP24A1的mRNA仍然會(huì)被誘導(dǎo)升高,這說(shuō)明敲低CYP24A1后并沒(méi)有減弱1α,25(OH)_2D_3對(duì)CYP24A1的誘導(dǎo)程度。(4)1α,25(OH)_2D_3誘導(dǎo)CYP24A1上調(diào)的相關(guān)基因表達(dá)譜分析:本部分研究結(jié)果表明,1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3細(xì)胞的105個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著性改變,其中85個(gè)基因表達(dá)上調(diào),20個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。而且差異表達(dá)基因經(jīng)功能富集后,我們發(fā)現(xiàn)差異基因中主要參與調(diào)控的包括細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞粘附、DNA模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程,以及影響TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等信號(hào)通路,這些與1α,25(OH)_2D_3抑制細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的機(jī)制值得深入研究。另外,我們也分析了在這些差異表達(dá)的基因中,與CYP24A1有共表達(dá)關(guān)系的基因共有39個(gè)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證分析CYP24A1可能通過(guò)影響KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差異基因的表達(dá)從而影響了1α,25(OH)_2D_3抑制細(xì)胞增殖和遷移的過(guò)程。結(jié)論:1、減少CYP24A1的表達(dá)可以增強(qiáng)1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的能力;2、減少CYP24A1的表達(dá)可以提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)1α,25(OH)_2D_3與卡鉑聯(lián)合作用的敏感性;3、CYP24A1啟動(dòng)子活性的提高主要與1α,25(OH)_2D_3的處理時(shí)間有關(guān);4、1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3細(xì)胞的105個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著性改變,其中85個(gè)基因表達(dá)上調(diào),20個(gè)基因表達(dá)下調(diào),差異基因涉及TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等通路。差異表達(dá)的基因中,與CYP24A1基因共表達(dá)的有39個(gè),CYP24A1可能通過(guò)影響KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差異基因影響1α,25(OH)_2D_3抑制細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程。
【圖文】：

圖 1.1 CYP24A1 敲低卵巢癌細(xì)胞系的建立SKOV-3 細(xì)胞穩(wěn)定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 結(jié)果顯示 CYP24A1 的 m平顯著降低（A），，Western blot 結(jié)果顯示 CYP24A1 的蛋白水平降低（VCAR-8 細(xì)胞穩(wěn)定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 結(jié)果顯示 CYP24A1 的 mR

圖 1.2 CYP24A1 過(guò)表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系的建立SKOV-3 細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá) CYP24A1 后，qRT-PCR 結(jié)果顯示 CYP24A1 的 m平顯著升高（A），Western blot 結(jié)果顯示 CYP24A1 的蛋白水平升高（BVCAR-8 細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá) CYP24A1 后，qRT-PCR 結(jié)果顯示 CYP24A1 的 m
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2711394