【摘要】：目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,有侵襲性強、遷移能力強、復發(fā)率高的特點。近年來對維生素D非經(jīng)典作用的研究表明,活性維生素D(1a,25-dihydroxy-vitaminD_3,1α,25(OH)_2D_3)有抑制腫瘤細胞增殖、促進分化的功能。但是,在課題組前期建立的小鼠卵巢表面上皮細胞自發(fā)惡性轉化模型中,長期使用1α,25(OH)_2D_3處理后,隨著細胞惡性程度的增加我們發(fā)現(xiàn)1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的能力減弱了,而在這過程中CYP24A1基因異常升高數(shù)千倍。CYP24A1基因編碼的24-羥化酶是維生素D代謝過程中的關鍵酶,它可以使1α,25(OH)_2D_3生成活性極低的代謝產(chǎn)物,從而維持血鈣濃度穩(wěn)定。CYP24A1在正常組織中的表達水平較低,然而有研究結果表明,腫瘤組織CYP24A1的表達增高,并且在1α,25(OH)_2D_3處理后其表達水平進一步異常升高。為了研究誘導型CYP24A1是否拮抗了1α,25(OH)_2D_3的抗腫瘤效果,本研究建立了穩(wěn)定CYP24A1低表達和過表達的卵巢癌細胞系,通過分析誘導型CYP24A1對卵巢癌細胞增殖和遷移能力的影響,以及其對卵巢癌細胞化療藥物敏感性的改變,初步探討誘導型CYP24A1對1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細胞增殖和遷移能力的影響。同時,利用基因芯片技術分析與誘導型CYP24A1共表達基因表達的變化情況,探究誘導型CYP24A1影響活性維生素D抗腫瘤的分子機制。為深入了解維生素D在腫瘤防治方面的應用提供可靠研究資料。方法:本研究分為兩個部分,(1)誘導型CYP24A1對1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細胞增殖和遷移能力的影響:建立穩(wěn)定低表達和過表達CYP24A1的卵巢癌細胞系。平板克隆檢測1α,25(OH)_2D_3對不同CYP24A1表達水平的卵巢癌細胞增殖能力的影響。劃痕實驗檢測1α,25(OH)_2D_3對不同CYP24A1表達水平的卵巢癌細胞遷移能力的影響。使用CCK-8實驗檢測細胞活力,分析不同CYP24A1水平是否影響了卵巢癌細胞對1α,25(OH)_2D_3和卡鉑聯(lián)合作用的敏感性。(2)1α,25(OH)_2D_3誘導CYP24A1上調的相關基因表達譜分析:使用CYP24A1啟動子序列改造熒光素酶報告系統(tǒng),加入1α,25(OH)_2D_3處理因素,分析其對CYP24A1啟動子的誘導情況,并用qRT-PCR檢測1α,25(OH)_2D_3對卵巢癌細胞CYP24A1基因表達的影響。使用100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3處理SKOV-3細胞,利用基因芯片技術,分析差異表達的基因以及其中與CYP24A1有共表達關系的基因,并實驗qRT-PCR方法進行驗證。anti分析誘導型CYP24A1影響1α,25(OH)_2D_3抑制腫瘤細胞增殖和遷移能力的可能機制。結果:(1)減少CYP24A1的表達對1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細胞增殖和遷移能力的影響:通過基因水平和蛋白水平的驗證,我們成功建立了CYP24A1基因穩(wěn)定低表達和過表達的卵巢癌SKOV-3和OVCAR-8細胞系。在1α,25(OH)_2D_3處理后,CYP24A1基因敲低組細胞增殖能力顯著低于陰性對照組(p0.001),并且CYP24A1過表達組細胞增殖能力顯著高于陰性對照組(p0.05)。這說明CYP24A1敲低后可以增強1α,25(OH)_2D_3抑制增殖的作用,同時CYP24A1基因過表達后則表現(xiàn)出對1α,25(OH)_2D_3抑制增殖作用的抵抗。平板克隆結果表明,在SKOV-3細胞中,CYP24A1敲低組細胞的克隆形成能力顯著低于陰性對照組(p0.001),并且在陰性對照組中1α,25(OH)_2D_3使其克隆形成率下降了59.78%,而1α,25(OH)_2D_3使CYP24A1敲低組細胞的克隆形成率下降了76.82%。這說明減少CYP24A1表達不僅可以降低卵巢癌細胞的增殖能力,還可以提高1α,25(OH)_2D_3對細胞增殖的抑制能力。劃痕實驗結果顯示,陰性對照組中1α,25(OH)_2D_3沒有顯著改變細胞遷移指數(shù),而在CYP24A1敲低組細胞中細胞遷移指數(shù)則顯著降低(p0.05)。并且在OVCAR-8細胞中,CYP24A1敲低組細胞的遷移指數(shù)也顯著低于陰性對照組(p0.05)。這說明減少CYP24A1表達不僅可以降低卵巢癌細胞的遷移能力,還可以提高1α,25(OH)_2D_3對細胞遷移的抑制能力。(2)CYP24A1的表達水平對卵巢癌細胞1α,25(OH)_2D_3聯(lián)合卡鉑處理敏感性的影響:CCK-8實驗結果顯示,1α,25(OH)_2D_3單獨處理卵巢癌細胞時,從48小時開始,細胞存活能力顯著下降,并且細胞活力隨處理時間的延長而下降,呈時間依賴性(p0.05)�？ㄣK單獨處理卵巢癌細胞時,細胞活力隨卡鉑濃度的升高而下降,呈劑量依賴效應(p0.001)。后續(xù)實驗選擇低濃度卡鉑(20 mg/L)聯(lián)合1α,25(OH)_2D_3(100 nmol/L)處理48小時,觀察聯(lián)合作用對卵巢癌細胞化療藥物增敏的效果。實驗結果顯示,100 nmol/L的1α,25(OH)_2D_3單獨處理、20 mg/L的卡鉑單獨處理以及聯(lián)合處理,均可以顯著降低細胞的存活能力(p0.001),并且1α,25(OH)_2D_3增強了卡鉑的抗增殖效果(p0.001),與80 mg/L的卡鉑單獨處理組的抑制作用相似。說明1α,25(OH)_2D_3可以顯著提高卵巢癌細胞對卡鉑的敏感性,我們還觀察到CYP24A1敲低組細胞還可以進一步降低聯(lián)合作用的細胞存活能力。(3)1α,25(OH)_2D_3對CYP24A1啟動子活性的影響:熒光素酶活性檢測實驗結果表明,1-100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3處理可以顯著提高SKOV-3細胞CYP24A1啟動子的活性;100 nmol/L 1α,25(OH)_2D_3處理SKOV-3細胞12小時后可以顯著提高CYP24A1啟動子活性。這說明CYP24A1啟動子活性的提高主要與1α,25(OH)_2D_3處理時間有關,與1α,25(OH)_2D_3的濃度關系不大。在CYP24A1基因敲低后,使用1α,25(OH)_2D_3處理后CYP24A1的mRNA仍然會被誘導升高,這說明敲低CYP24A1后并沒有減弱1α,25(OH)_2D_3對CYP24A1的誘導程度。(4)1α,25(OH)_2D_3誘導CYP24A1上調的相關基因表達譜分析:本部分研究結果表明,1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3細胞的105個基因表達發(fā)生顯著性改變,其中85個基因表達上調,20個基因表達下調。而且差異表達基因經(jīng)功能富集后,我們發(fā)現(xiàn)差異基因中主要參與調控的包括細胞增殖的正調控、細胞粘附、DNA模板的轉錄調控等生物學過程,以及影響TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等信號通路,這些與1α,25(OH)_2D_3抑制細胞增殖和遷移相關的機制值得深入研究。另外,我們也分析了在這些差異表達的基因中,與CYP24A1有共表達關系的基因共有39個。經(jīng)過驗證分析CYP24A1可能通過影響KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差異基因的表達從而影響了1α,25(OH)_2D_3抑制細胞增殖和遷移的過程。結論:1、減少CYP24A1的表達可以增強1α,25(OH)_2D_3抑制卵巢癌細胞增殖和遷移的能力;2、減少CYP24A1的表達可以提高卵巢癌細胞對1α,25(OH)_2D_3與卡鉑聯(lián)合作用的敏感性;3、CYP24A1啟動子活性的提高主要與1α,25(OH)_2D_3的處理時間有關;4、1α,25(OH)_2D_3使SKOV-3細胞的105個基因表達發(fā)生顯著性改變,其中85個基因表達上調,20個基因表達下調,差異基因涉及TGF-βsignaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等通路。差異表達的基因中,與CYP24A1基因共表達的有39個,CYP24A1可能通過影響KIT、TRPV6、IGFBP3、GRK5、IGFBP1等差異基因影響1α,25(OH)_2D_3抑制細胞增殖和遷移過程。
【圖文】：

圖 1.1 CYP24A1 敲低卵巢癌細胞系的建立SKOV-3 細胞穩(wěn)定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 結果顯示 CYP24A1 的 m平顯著降低（A），，Western blot 結果顯示 CYP24A1 的蛋白水平降低（VCAR-8 細胞穩(wěn)定敲低 CYP24A1 后，qRT-PCR 結果顯示 CYP24A1 的 mR

圖 1.2 CYP24A1 過表達卵巢癌細胞系的建立SKOV-3 細胞穩(wěn)定過表達 CYP24A1 后，qRT-PCR 結果顯示 CYP24A1 的 m平顯著升高（A），Western blot 結果顯示 CYP24A1 的蛋白水平升高（BVCAR-8 細胞穩(wěn)定過表達 CYP24A1 后，qRT-PCR 結果顯示 CYP24A1 的 m
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

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本文編號：2711394