【摘要】：目的妊娠期間低甲狀腺素血癥,又稱妊娠期低T4血癥,是指妊娠期間血清游離甲狀腺素(maternal free thyroxine,FT4)低于妊娠特異性參考范圍下限,而血清促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)水平處于正常范圍。由于胎兒的甲狀腺于妊娠12周開始發(fā)育,于妊娠18至20周左右發(fā)揮其功能,此前胎兒發(fā)育所需的甲狀腺激素均依賴母體供給,因此在大腦發(fā)育的關(guān)鍵時期,即使輕度的甲狀腺激素減少也會對腦發(fā)育造成不利影響。2004年,Vermiglio等人的研究發(fā)現(xiàn)碘缺乏地區(qū)低T4血癥婦女后代注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)發(fā)生風(fēng)險增加,此后人群研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)妊娠早期母體低T4血癥可以造成后代ADHD風(fēng)險增加。ADHD是兒童及青少年時期最常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病之一。全球?qū)W齡期兒童及青少年患病率約為5.29%,男女比例約為3:1,甚至更高。甲狀腺激素可以影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育。多巴胺(DA)是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的一種。中樞神經(jīng)遞質(zhì)生成后,儲存在囊泡內(nèi)。當(dāng)動作電位到達神經(jīng)末梢時,在鈣離子的參與下,以胞吐的方式進入突觸間隙,突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì),一部分發(fā)揮生理作用,被突觸后膜的受體攝取,另一部分通過多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)再攝取和單胺氧化酶(MAO)的酶促降解被迅速清除。神經(jīng)遞質(zhì)的形成以及突觸結(jié)構(gòu)的發(fā)育均是甲狀腺激素作用的靶點。ADHD的發(fā)病機制復(fù)雜,基礎(chǔ)研究顯示,ADHD存在多巴胺能神經(jīng)通路異常,ADHD大鼠、小鼠存在多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)和多巴胺受體(DAR)異常。突觸小體相關(guān)蛋白25(SNAP-25)基因作為一種甲狀腺反應(yīng)基因也參與了ADHD的發(fā)生。目前低T4血癥影響后代發(fā)生ADHD的研究局限于人群研究,并無動物實驗證實,具體發(fā)生機制尚處在爭議中。本研究旨在建立碘營養(yǎng)正常的低T4血癥大鼠模型,通過多種動物行為學(xué)評估方法,觀察妊娠期低T4血癥是否可以導(dǎo)致后代仔鼠ADHD發(fā)生;通過測定仔鼠腦內(nèi)不同位置多巴胺能神經(jīng)元受體(DRD1-5)及下游通路各項指標(biāo)的變化,探討低T4血癥對仔鼠ADHD行為的可能影響因素;同時通過對妊娠早期低T4血癥婦女進行Conners問卷調(diào)查,觀察其后代是否出現(xiàn)多動評分增高的現(xiàn)象,通過臨床和動物實驗探討低T4血癥對后代ADHD發(fā)生的影響。研究方法第一部分1、8周齡wistar雌性大鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,分為正常對照組(n=14),低T4血癥組(n=18),甲減組(n=18),特殊飲水喂養(yǎng)9周,檢測甲功,并驗證成模后,與公鼠合籠。2、通過行為學(xué)方法檢測后代雄性仔鼠的異常表現(xiàn)。通過延遲強化實驗、曠場實驗、破除強化實驗,評估妊娠期母體低T4血癥后代多動癥樣表現(xiàn)。通過0迷宮實驗、Morris水迷宮實驗、轉(zhuǎn)棒實驗等行為學(xué)實驗,進一步評估后代仔鼠其他精神障礙,以及空間學(xué)習(xí)記憶能力、運動能力。3、應(yīng)用RT-PCR方法檢測后代雄性仔鼠腦組織甲狀腺激素反應(yīng)基因SNAP-25以及多巴胺通路指標(biāo)m RNA的表達。4、應(yīng)用Western Blot檢測多巴胺受體相關(guān)通路PI3K/AKT/GSK3β以及c AMP/CREB/AKT通路蛋白水平。5、應(yīng)用免疫熒光檢測仔鼠出生時腦海馬及皮層SNAP-25蛋白水平。第二部分1、研究對象來自2011-2014年期間遼寧省沈陽、大連等城市(碘適量地區(qū))在本地居住五年以上,年齡在19-40歲之間的妊娠早期婦女。研究對象均于清晨空腹采血,檢測血清TSH、FT4、TPOAb。排除臨床甲狀腺疾病、雙胎妊娠、遺傳疾病個人史或家族史以及其他嚴(yán)重慢性疾病史妊娠婦女后,根據(jù)本研究組制定的妊娠特異性甲狀腺功能診斷標(biāo)準(zhǔn)對其進行篩選和分組,并對人群一般特征進行評估。2、對接受左甲狀腺素(LT4)干預(yù)的低T4血癥婦女,治療起始劑量為50μg/日,并根據(jù)隨訪甲功調(diào)整用藥,以保證妊娠期TSH、FT4處于正常范圍,最大劑量不超過100μg/日。3、對所有婦女進行隨訪,填寫Conners家長評定量表,對后代5歲左右兒童進行多動評估。比較低T4血癥組、LT4干預(yù)組與正常對照組問卷評分有無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果第一部分1、低T4血癥母鼠成模情況血清TSH及FT4測定結(jié)果顯示:PTU特殊飲水喂養(yǎng)9周后,與對照組相比,低T4血癥組大鼠血清TSH無顯著差異,FT4顯著降低(p0.05);甲減組大鼠血清TSH顯著升高(p0.05),FT4顯著降低(p0.05)。2、仔鼠行為學(xué)實驗評估結(jié)果(1)延遲強化(DR)實驗中,與對照組相比,低T4血癥組后代雄性仔鼠獲得大額獎賞明顯減少(p0.05),提示低T4血癥組雄性仔鼠存在沖動行為。與對照組相比,甲減組后代雄性仔鼠獲得大額獎賞明顯減少(p0.05),提示甲減組雄性仔鼠存在沖動行為。(2)破除強化實驗(EXT)中,與正常對照組相比,低T4組、甲減組雄性仔鼠在破除強化實驗的第一天選擇更多觸碰即時獎賞(反應(yīng)正確率)(p0.01),較少觸碰延遲大額獎賞(p0.01),但觸碰屏幕總次數(shù)(反應(yīng)頻率)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),低T4組、甲減組雄性仔鼠反應(yīng)正確率降低,提示存在持續(xù)注意缺陷。低T4組、甲減組雄性仔鼠在EXT的第二天觸碰延遲獎賞無明顯減少(p0.05),觸碰屏幕總次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(3)曠場實驗中,與對照組相比,低T4血癥組雄性仔鼠理毛時間明顯延長(p0.05),存在活動增多現(xiàn)象。甲減組后代理毛時間較對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(4)水迷宮實驗中,與對照組相比,低T4血癥組、甲減組雄性仔鼠逃避潛伏期明顯延長(p0.05),提示存在空間學(xué)習(xí)記憶障礙。與對照組相比,低T4血癥組、甲減組仔鼠游泳距離及游泳速度無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)�？臻g探索實驗中,低T4血癥組后代雄鼠穿越平臺所在象限次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),甲減組后代仔鼠穿越平臺所在象限次數(shù)較對照組明顯減少(p0.05)。(5)轉(zhuǎn)棒實驗中,與對照組相比,低T4血癥組雄性仔鼠平均掉落時間及掉落速度無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),甲減組平均平均掉落時間明顯縮短、掉落速度明顯降低(p0.05),提示存在運動功能障礙。(6)0迷宮實驗中,與對照組相比,低T4血癥組、甲減組雄性仔鼠在開臂停留時間無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),無焦慮行為。3、P120天仔鼠體重、大腦重、小腦重、腦重與體重比結(jié)果與對照組相比,低T4血癥組及甲減組后代雄鼠大腦重、小腦重及體重?zé)o明顯差異(p0.05),大腦、小腦與體重之比無明顯差異(p0.05)。3、P120天雄性仔鼠腦組織RT-PCR結(jié)果(1)對仔鼠腦組織海馬區(qū)域的m RNA進行檢測,與對照組相比,低T4血癥組SNAP-25 m RNA表達顯著升高(p0.05),甲減組SNAP-25 m RNA表達顯著升高(p0.05),提示低T4血癥組及甲減組存在突觸囊泡釋放異常。(2)對仔鼠腦前額葉皮質(zhì)區(qū)域的m RNA進行檢測,與對照組相比,低T4血癥組DRD1及DRD5 m RNA表達顯著降低(p0.05),甲減組DRD1及DRD5 m RNA表達顯著降低(p0.05)。(3)對仔鼠腦皮質(zhì)(除外前額葉)區(qū)域的m RNA進行檢測,與對照組相比,低T4血癥組、甲減組SNAP-25 m RNA表達顯著降低(p0.05);甲減組MAOA、MAOB m RNA表達顯著降低(p0.05),低T4血癥組表達無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)(4)對仔鼠腦紋狀體區(qū)域的m RNA進行檢測,與對照組相比,低T4血癥組MAOA、MAOB m RNA表達顯著降低(p0.05),甲減組表達無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(5)對仔鼠小腦區(qū)域的m RNA進行檢測,與對照組相比,低T4血癥組DRD1m RNA表達顯著降低(p0.05),甲減組表達無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。4、P120天雄性仔鼠腦組織Western Blot結(jié)果(1)對三組仔鼠腦海馬區(qū)域進行SNAP-25蛋白水平檢測。與對照組相比,低T4血癥組海馬SNAP-25蛋白水平顯著升高(p0.05)。(2)對仔鼠腦前額葉皮質(zhì)區(qū)域進行多巴胺受體通路PI3K/AKT/GSK3β通路以及c AMP/CREB/AKT通路蛋白水平檢測。與對照組相比,低T4血癥組前額葉皮層PI3K蛋白水平明顯升高(p0.05),而其下游各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);甲減組仔鼠各蛋白表達與對照組相比未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。與對照組相比,甲減組仔鼠前額葉CREB蛋白水平顯著升高(p0.05),低T4血癥組雖有升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5、P0天雄性仔鼠腦海馬及皮層免疫熒光結(jié)果對P0天雄性仔鼠腦組織切片免疫熒光染色,與對照組相比,低T4組及甲減組仔鼠海馬SNAP-25熒光強度明顯升高,低T4血癥組皮層SNAP-25熒光強度明顯下降,甲減組皮層SNAP-25熒光強度未觀察到顯著下降。第二部分1、填寫問卷的妊娠早期正常對照組57例,單純低T4血癥組57例,單純低T4血癥LT4干預(yù)組32例。比較各組患者一般資料,與對照組相比,妊娠早期低T4組患者、LT4干預(yù)組患者BMI、FT4、TSH水平有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),其余基線指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。與低T4血癥組相比,LT4干預(yù)組患者中等收入人數(shù)較多(p0.05),低收入人數(shù)較少(p0.05),其余基線水平無統(tǒng)計學(xué)差異。2、與正常對照組相比,單純低T4血癥組學(xué)習(xí)問題評分顯著升高(p0.05),多動指數(shù)評分顯著升高(p0.05)。后代男孩中,與對照組相比,單純低T4血癥組出現(xiàn)多動-沖動評分升高(p0.05),后代女孩各項評分無統(tǒng)計學(xué)差異。3、與低T4血癥組相比,LT4干預(yù)組后代男孩多動-沖動評分得到改善(p0.05),與對照組相比,LT4干預(yù)組后代整體學(xué)習(xí)障礙以及多動指數(shù)評分沒有改善(p0.05),同時后代整體心身障礙指數(shù)評分增加(p0.05)。4、相關(guān)分析顯示,多動指數(shù)與母親妊娠早期FT4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.236,p0.05),與母親妊娠早期TSH呈正相關(guān)(r=0.191,p0.05);焦慮指數(shù)與母親妊娠早期TSH呈正相關(guān)(r=0.187,p0.05);心身障礙評分與母親妊娠早期BMI呈正相關(guān)(r=0.244,p0.05)。結(jié)論1、妊娠期低T4血癥母鼠后代雄性仔鼠存在ADHD樣改變。2、妊娠期低T4血癥母鼠后代雄性仔鼠ADHD樣改變,可能與母體甲狀腺激素缺乏,進而影響子代海馬神經(jīng)元突觸囊泡釋放、腦皮層多巴胺受體通路指標(biāo)改變有關(guān)。3、與正常對照組相比,妊娠早期低T4血癥婦女后代出現(xiàn)學(xué)習(xí)困難,多動指數(shù)升高;后代男孩多動評分升高,而后代女孩沒有差異。4、與對照組相比,LT4干預(yù)組可以改善后代男孩多動-沖動評分,但沒有改善后代整體學(xué)習(xí)障礙以及多動指數(shù)評分,同時增加后代整體心身障礙指數(shù)評分。
【圖文】：

步驟：開眼時間從仔鼠出生后第 10 天開始觀察，以雙眼全部可錄三組大鼠整窩仔鼠全部陽性的日期。翻正反射實驗在仔鼠出大鼠籠具底部平鋪約 5cm 厚度的鋸沫墊料，在距離籠具底端 3仔鼠的肩部及跨部使其仰臥，待其停止掙扎后，迅速撤離雙手，位。仔鼠能夠在空中翻正身體，，以四肢平穩(wěn)落地則標(biāo)記為通過；為未通過。通過實驗的仔鼠做好標(biāo)記，第二天不再對其進行測試，將仔鼠放回母鼠身邊。用籠中帶有母鼠氣味的墊料擦拭仔鼠身味改變而拒絕哺乳仔鼠。記錄三組大鼠各窩仔鼠全部翻正需要的木實驗（balance beam）目的：檢測仔鼠精細(xì)運動協(xié)調(diào)能力。步驟：在仔鼠出生后第 21 天脫離哺乳后進行。首先搭建平衡木”字形，寬度逐漸變窄，上層木板最寬處 6.5cm，最窄處 1.7cm；0.5cm，最窄處 5.8cm。搭建好的示意圖見圖 2。

圖 5. 轉(zhuǎn)棒實驗示意圖orris water maze，MWM）orris 水迷宮評估產(chǎn)后 40 天仔鼠空間學(xué)習(xí) 水迷宮由水迷宮裝置、圖像自動采集系統(tǒng)迷宮宮體由一個直徑 120cm 的水池和一。Nodus 軟件分析系統(tǒng)可以自動采集動、運動軌跡等參數(shù)。 水迷宮平均分為四個象限，平臺淹沒于水登陸），固定于第四象限（平臺與池壁、平臺位置固定不變。用溫度計監(jiān)控水溫過高或過低造成動物應(yīng)激。實驗過程中
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714.256;R749.94

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 史曉光;滕曉春;單忠艷;于曉會;李佳;陳彥彥;滕衛(wèi)平;;妊娠早期碘營養(yǎng)狀況與甲狀腺功能關(guān)系的流行病學(xué)調(diào)查[J];中國實用內(nèi)科雜志;2009年06期

2 符娜;李明;秦炯;;中國兒童Brown注意缺陷障礙量表與Conners家長量表的相關(guān)性[J];實用兒科臨床雜志;2007年12期

本文編號：2704264