發(fā)布時間：2020-06-08 13:53

【摘要】：目的:子癇前期(PE)是一種嚴重的妊娠并發(fā)癥,絨毛外滋養(yǎng)細胞(EVT)侵襲和螺旋動脈重構異常是其發(fā)病的關鍵所在。s FRP5作為Wnt信號通路的負調控因子,其在滋養(yǎng)細胞侵襲、血管生成等過程中的作用機制還未清楚。本課題旨在檢測sFRP5在正常妊娠期血清、子癇前期血清中的表達差異;研究sFRP5對于滋養(yǎng)細胞以及臍靜脈內皮細胞的功能學變化(如侵襲、遷移等)的作用并進一步深入其產(chǎn)生機理;探討s FRP5在子癇前期中可能的分子層面的改變與變化機制。方法:選取在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科進行剖宮產(chǎn)足月分娩的正常孕婦術前血清15例以及子癇前期孕婦術前血清15例,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術檢測各組血清中s FRP5蛋白分泌水平;通過慢病毒轉染進行基因的過表達,使絨毛外滋養(yǎng)細胞HTR8/svneo和人類臍靜脈內皮細胞HUVEC中sFRP5基因表達升高;使用流式細胞技術、熒光顯微技術以及Western blotting測試其過表達效率;對Wnt/β-catenin信號通路使用其激活劑LiCl增加信號通路的激活程度;采用cck8實驗檢測細胞增殖;transwell小室和Matrigel侵襲實驗檢測HTR8/svneo細胞的侵襲性;劃痕實驗檢測HUVEC細胞遷移性;采用蛋白印記技術驗證sFRP5與β-catenin等通路蛋白表達量之間的關系。結果:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測結果顯示,s FRP5蛋白在子癇前期(PE)組血清中表達明顯高于對照組血清;sFRP5過表達后細胞慢病毒轉染效率可達95%以上,蛋白印記顯示過表達后sFRP5表達量升高,證明過表達有效;cck8檢測Li Cl在20μM濃度下,對兩種細胞作用24h,明顯促進細胞增殖;Transwell侵襲實驗結果顯示,過表達后HTR8/svneo細胞顯著降低了其侵襲能力,分別用LiCl處理24h后,可見過表達組和對照組細胞侵襲性有所升高;劃痕實驗顯示過表達后HUVEC細胞遷移能力明顯下降,而分別用LiCl處理24h后,可見過表達組和對照組細胞遷移性較處理前有所升高;Western blotting技術檢測可發(fā)現(xiàn)過表達sFRP5后,β-catenin,p-GSK3β皆表達下降,使用LiCl處理24小時后,兩種表達量皆有所升高。結論:sFRP5抑制滋養(yǎng)細胞、內皮細胞的侵襲、遷移能力,其抑制作用可能通過Wnt/β-catenin信號通路介導,并進一步參與子癇前期的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文2.2 sFRP5 過表達轉染慢病毒轉染 HTR8/SVneo 細胞及 HUVEC 細胞成功2.2.1 熒光顯微鏡檢測 sFRP5 過表達慢病毒轉染 HTR8/SVneo 細胞和 HUVEC 細胞的效率滴度為 1*108TU/ml 的慢病毒轉染 HTR8/SVneo 細胞的 MOI 值為 40-50，HUVEC 細胞株的 MOI 值為 10-20，轉染 72 小時后，在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色熒光且細胞生長良好。轉染了 sFRP5 過表達的慢病毒的細胞株在經(jīng)過嘌呤霉素篩選后，轉染成功的比例可達 90%。（圖 2.1）

圖 2.2 流式細胞儀檢測 HTR8/SVneo 細胞及 HUVEC 細胞綠色熒光（轉染效率）A. 陰性對照（未轉染慢病毒的 HTR8/SVneo 細胞） B. 過表達 sFRP5 轉染慢病毒的 HTR8/SVneo 細胞C.空載體慢病毒的 HTR8/SVneo 細胞 D.陰性對照（未轉染慢病毒的 HUVEC 細胞） E.過表達 sFRP轉染慢病毒的 HUVEC 細胞 F.空載體慢病毒的 HUVEC 細胞Figure 2.2 Detection of green fluorescence (transfection efficiency) in HTR8/SVneo and HUVEC cells by flocytometryA.Negative controls (HTR8/SVneo cells not transfected with lentiviruses) B. HTR8/SVneo cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 C. HTR8/SVneo cells with empty vectorlentivirus D.Negative controls (HUVEC cells not transfected with lentiviruses) E.HUVEC cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 F. HUVEC cells with empty vector lentiviru2.2.3 蛋白印記法（WB）檢測病毒轉染后HTR8/SVneo細胞和HUVEC細胞sFRP蛋白的表達HTR8/SVneo 細胞株及 HUVEC 細胞株經(jīng)過轉染慢病毒后，，通過蛋白印記法（WB）檢測過表達 sFRP5 組及空載體組兩者 sFRP5 蛋白的表達含量，來確定過表達轉染的成功。WB 結果顯示 sFRP5 過表達后兩者 sFRP5 蛋白表達含量顯著上
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.244

【參考文獻】

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1 張麗娟;張鳳華;湯麗麗;楊偉紅;張雪;;妊娠期肝內膽汁淤積癥與胎兒損傷[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2013年06期

本文編號：2703183