【摘要】：目的:子癇前期(PE)是一種嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥,絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)侵襲和螺旋動(dòng)脈重構(gòu)異常是其發(fā)病的關(guān)鍵所在。s FRP5作為Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,其在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、血管生成等過(guò)程中的作用機(jī)制還未清楚。本課題旨在檢測(cè)sFRP5在正常妊娠期血清、子癇前期血清中的表達(dá)差異;研究sFRP5對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能學(xué)變化(如侵襲、遷移等)的作用并進(jìn)一步深入其產(chǎn)生機(jī)理;探討s FRP5在子癇前期中可能的分子層面的改變與變化機(jī)制。方法:選取在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科進(jìn)行剖宮產(chǎn)足月分娩的正常孕婦術(shù)前血清15例以及子癇前期孕婦術(shù)前血清15例,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)檢測(cè)各組血清中s FRP5蛋白分泌水平;通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因的過(guò)表達(dá),使絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/svneo和人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中sFRP5基因表達(dá)升高;使用流式細(xì)胞技術(shù)、熒光顯微技術(shù)以及Western blotting測(cè)試其過(guò)表達(dá)效率;對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路使用其激活劑LiCl增加信號(hào)通路的激活程度;采用cck8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖;transwell小室和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR8/svneo細(xì)胞的侵襲性;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞遷移性;采用蛋白印記技術(shù)驗(yàn)證sFRP5與β-catenin等通路蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)結(jié)果顯示,s FRP5蛋白在子癇前期(PE)組血清中表達(dá)明顯高于對(duì)照組血清;sFRP5過(guò)表達(dá)后細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95%以上,蛋白印記顯示過(guò)表達(dá)后sFRP5表達(dá)量升高,證明過(guò)表達(dá)有效;cck8檢測(cè)Li Cl在20μM濃度下,對(duì)兩種細(xì)胞作用24h,明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)后HTR8/svneo細(xì)胞顯著降低了其侵襲能力,分別用LiCl處理24h后,可見(jiàn)過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞侵襲性有所升高;劃痕實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)后HUVEC細(xì)胞遷移能力明顯下降,而分別用LiCl處理24h后,可見(jiàn)過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞遷移性較處理前有所升高;Western blotting技術(shù)檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)sFRP5后,β-catenin,p-GSK3β皆表達(dá)下降,使用LiCl處理24小時(shí)后,兩種表達(dá)量皆有所升高。結(jié)論:sFRP5抑制滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、遷移能力,其抑制作用可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo),并進(jìn)一步參與子癇前期的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.2 sFRP5 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染 HTR8/SVneo 細(xì)胞及 HUVEC 細(xì)胞成功2.2.1 熒光顯微鏡檢測(cè) sFRP5 過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染 HTR8/SVneo 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞的效率滴度為 1*108TU/ml 的慢病毒轉(zhuǎn)染 HTR8/SVneo 細(xì)胞的 MOI 值為 40-50，HUVEC 細(xì)胞株的 MOI 值為 10-20，轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)綠色熒光且細(xì)胞生長(zhǎng)良好。轉(zhuǎn)染了 sFRP5 過(guò)表達(dá)的慢病毒的細(xì)胞株在經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選后，轉(zhuǎn)染成功的比例可達(dá) 90%。（圖 2.1）

圖 2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) HTR8/SVneo 細(xì)胞及 HUVEC 細(xì)胞綠色熒光（轉(zhuǎn)染效率）A. 陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)染慢病毒的 HTR8/SVneo 細(xì)胞） B. 過(guò)表達(dá) sFRP5 轉(zhuǎn)染慢病毒的 HTR8/SVneo 細(xì)胞C.空載體慢病毒的 HTR8/SVneo 細(xì)胞 D.陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)染慢病毒的 HUVEC 細(xì)胞） E.過(guò)表達(dá) sFRP轉(zhuǎn)染慢病毒的 HUVEC 細(xì)胞 F.空載體慢病毒的 HUVEC 細(xì)胞Figure 2.2 Detection of green fluorescence (transfection efficiency) in HTR8/SVneo and HUVEC cells by flocytometryA.Negative controls (HTR8/SVneo cells not transfected with lentiviruses) B. HTR8/SVneo cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 C. HTR8/SVneo cells with empty vectorlentivirus D.Negative controls (HUVEC cells not transfected with lentiviruses) E.HUVEC cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 F. HUVEC cells with empty vector lentiviru2.2.3 蛋白印記法（WB）檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后HTR8/SVneo細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞sFRP蛋白的表達(dá)HTR8/SVneo 細(xì)胞株及 HUVEC 細(xì)胞株經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒后，，通過(guò)蛋白印記法（WB）檢測(cè)過(guò)表達(dá) sFRP5 組及空載體組兩者 sFRP5 蛋白的表達(dá)含量，來(lái)確定過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染的成功。WB 結(jié)果顯示 sFRP5 過(guò)表達(dá)后兩者 sFRP5 蛋白表達(dá)含量顯著上
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R714.244

【參考文獻(xiàn)】

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1 張麗娟;張鳳華;湯麗麗;楊偉紅;張雪;;妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥與胎兒損傷[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

本文編號(hào)：2703183