【摘要】：第一部分BMSCs在竇前卵泡體外培養(yǎng)中的作用研究【目的】觀察BMSCs在竇前卵泡體外培養(yǎng)中的作用。【方法】獲取2周齡小鼠竇前卵泡,和BMSCs在transwell小室內(nèi)體外共培養(yǎng)為BMSCs共培養(yǎng)組,相同條件下未處理的小鼠竇前卵泡為體外單獨(dú)培養(yǎng)組,體內(nèi)獲取的成熟卵母細(xì)胞為體內(nèi)對(duì)照組。觀察竇前卵泡生長(zhǎng)速度、卵母細(xì)胞成熟率,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)MⅡ期紡錘體異常率,化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)培養(yǎng)上清中雌激素濃度。【結(jié)果】BMSCs共培養(yǎng)對(duì)竇前卵泡體外培養(yǎng)發(fā)育速度無(wú)明顯影響,BMSCs共培養(yǎng)后竇前卵泡存活率并沒(méi)有明顯變化,共培養(yǎng)組竇腔形成率(49.22%)高于單獨(dú)培養(yǎng)組(29.47%)(P0.05),共培養(yǎng)組卵母細(xì)胞成熟率(31.75%)高于單獨(dú)培養(yǎng)組(16.84%)(P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示體外單獨(dú)培養(yǎng)組卵母細(xì)胞錘體形態(tài)發(fā)生明顯異常,微管排列紊亂;共培養(yǎng)組及體內(nèi)對(duì)照組紡錘體形態(tài)完整,微管排列整齊。體外共培養(yǎng)組卵母細(xì)胞紡錘體異常率(34.78%)顯著低于體外單獨(dú)培養(yǎng)組(52.17%)(P0.05),但仍然高于體內(nèi)成熟組(25.53%)(P0.05)。培養(yǎng)第四天開(kāi)始,共培養(yǎng)組培養(yǎng)液中雌激素明顯高于體外單獨(dú)培養(yǎng)組(P0.05)�！窘Y(jié)論】BMSCs共培養(yǎng)后竇前卵泡的竇腔形成率及卵母細(xì)胞成熟率升高,紡錘異常率下降,培養(yǎng)基中雌激素分泌增加,說(shuō)明了BMSCs共培養(yǎng)可以提高竇前卵泡體外培養(yǎng)的質(zhì)量以及顆粒細(xì)胞的分泌功能。第二部分3D培養(yǎng)體系構(gòu)建及安全性檢測(cè)【目的】構(gòu)建最佳3D培養(yǎng)體系,明確其安全性�！痉椒ā繕�(gòu)建四種3D培養(yǎng)體系:膠原蛋白體系、藻酸鹽體系、膠原蛋白+DNA水凝膠體系、藻酸鹽+DNA水凝膠體系,同時(shí)以2D培養(yǎng)體系作為對(duì)照。將五種體系分別與竇前卵泡共培養(yǎng),觀察卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育情況;將五種體系分別與GCs與BMSCs共培養(yǎng)72h,采用Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞及BMSCs凋亡情況,Western blot分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)情況�！窘Y(jié)果】四種3D培養(yǎng)體系構(gòu)建成功,竇前卵泡在四種3D培養(yǎng)體系中均可以存活生長(zhǎng)發(fā)育,其中藻酸鹽+DNA水凝膠組卵泡發(fā)育速度最快,顆粒細(xì)胞層數(shù)最多;GCs和BMSCs在四種培養(yǎng)體系中均生長(zhǎng)良好,凋亡流式檢測(cè)顯示各組凋亡指數(shù)均小于1%,凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平在各組間無(wú)顯著性差異(P0.05)�！窘Y(jié)論】四種3D培養(yǎng)體系對(duì)GCs和BMSCs的增殖無(wú)影響;鑒于竇前卵泡在藻酸鹽+DNA水凝膠體系中發(fā)育最好,初步確定藻酸鹽+DNA水凝膠培養(yǎng)體系為最優(yōu)體系。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 SCs 的培養(yǎng)種的細(xì)胞種類(lèi)較多，大部分細(xì)胞呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，其中種 24h 后部分細(xì)胞貼附于瓶底，部分細(xì)胞仍懸浮在培養(yǎng)液中。經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞小而且形態(tài)多樣。培養(yǎng) 2 周左右，細(xì)胞融合成可進(jìn)行細(xì)胞的首次傳代。傳代后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快。傳 3-4 代的長(zhǎng)梭形。（圖 1-1）

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文圖 1-2 BMSCs（P4）的流式鑒定圖2 BMSCs 誘導(dǎo)分化BMSCs 成骨誘導(dǎo) 21 天，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后可見(jiàn)紅色誘導(dǎo) 21 天，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂滴，經(jīng)油紅 O 染色，，可見(jiàn)紅色脂滴。說(shuō)明MSCs 具有多功能干性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖 1-3）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R714.8

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本文編號(hào)：2700513