【摘要】：研究背景:中國(guó)不孕不育發(fā)病率約占育齡人群的10%至12%,其中女方因素中的30%是由排卵障礙引起的。卵子發(fā)育是在女性的卵巢中以卵泡的形式進(jìn)行,在發(fā)育過程中受著激素與生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié),當(dāng)發(fā)育成熟出現(xiàn)異常時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同形式的排卵障礙。TGF-β家族是在卵母細(xì)胞成熟中重要的調(diào)節(jié)因子,研究發(fā)現(xiàn)卵子的成熟同其周圍的顆粒細(xì)胞密切相關(guān)。GDF-9和AMH同屬于TGF-β家族,不僅在卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要的作用,而且在不孕不育癥的治療與診斷等臨床方面具有重要的指標(biāo)特征。本論文以GDF9和AMH為研究對(duì)象,對(duì)其在排卵障礙患者臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)分析,并且對(duì)GDF9在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟體系的應(yīng)用進(jìn)行了探索,通過對(duì)排卵障礙病例的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,進(jìn)一步揭示GDF9和AMH在卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育中起到的作用。第一部分 生長(zhǎng)分化因子9(GDF-9)對(duì)卵巢功能的評(píng)價(jià)應(yīng)用目的:1對(duì)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行ICSI女性患者的顆粒細(xì)胞GDF9表達(dá)進(jìn)行定量分析,同患者對(duì)超排激素(主要為FSH)的敏感度進(jìn)行協(xié)同分析,以期找出二者之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。2以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,在小鼠的IVM中添加GDF9與FSH來觀察對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響,為今后GDF9在人類的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的應(yīng)用進(jìn)行理論探索。方法:1選取2017年1月到2018年1月就診于我院行卵胞漿內(nèi)單精子注射的女性患者72例,依據(jù)取卵時(shí)獲得平均直徑14 mm的卵泡數(shù)目進(jìn)行分組:卵泡數(shù)≤5個(gè)為卵巢低反應(yīng)組,6～19個(gè)為中反應(yīng)組,≥20個(gè)為高反應(yīng)組,各24例。觀察卵巢不同反應(yīng)組顆粒細(xì)胞GDF-9基因表達(dá)情況,以及GDF-9表達(dá)與排卵障礙的相關(guān)性。2將超排獲得的小鼠卵母細(xì)胞分別培養(yǎng)在M199、M199+FSH+GDF9、M199+FSH、M199+GDF9中體外成熟成熟24h小時(shí)后,體外受精并統(tǒng)計(jì)卵裂率與囊胚率。結(jié)果:1.72例IVF患者中卵巢低反應(yīng)組24例,中反應(yīng)組24例,高反應(yīng)組24例;各組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、E2水平、Gn用量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.在患者卵泡壁顆粒細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞中均有GDF-9mRNA表達(dá),3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。低反應(yīng)組卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞的GDF-9mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于中反應(yīng)組及高反應(yīng)組(均P0.05)。3.卵巢低、中、高反應(yīng)組的獲卵數(shù)分別為:(3.45±0.97)、(12.38±3.36)、(24.38±4.86)個(gè)。卵泡壁顆粒細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞GDF-9mRNA表達(dá)量與超排卵獲卵數(shù)呈正相關(guān)。4無(wú)論是單獨(dú)添加FSH、GDF9,還是協(xié)同添加FSH、GDF9,對(duì)于胚胎的卵裂率與囊胚率都極大的提升且差異顯著(P0.05)。外源性FSH和GDF9對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟都有著促進(jìn)作用,并且這種促進(jìn)作用對(duì)卵母細(xì)胞的成熟率差異不明顯(85.6%、81.5%)。單獨(dú)FSH、GDF9實(shí)驗(yàn)組二者之間的囊胚率無(wú)顯著差異,單獨(dú)添加同協(xié)同添加實(shí)驗(yàn)組對(duì)比差異顯著(P0.05)。結(jié)論:結(jié)果表明人類卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞也存在GDF9的表達(dá),說明卵泡在發(fā)育階段不僅存在卵子通過旁分泌方式分泌可溶性分子調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育,而且也存在顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞通過自分泌的形式調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。不同患者的顆粒細(xì)胞GDF9表達(dá)的量同患者對(duì)外源FSH刺激的敏感度成正比。分析因?yàn)镚DF9的表達(dá)調(diào)控同F(xiàn)SH保持一致,因此當(dāng)患者體內(nèi)的GDF9表達(dá)量較高時(shí),FSH的受體表達(dá)量也到了高點(diǎn),此時(shí)患者對(duì)外源的FSH也可以起到最大的促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用。因此,利用GDF濃度可以作為超排效果的前期評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,可以合理的調(diào)整患者的超排與取卵方案,不僅可以節(jié)省試管嬰兒的操作流程,也可以為患者節(jié)省治療費(fèi)用。體外成熟體系中單獨(dú)添加FSH、GDF9或協(xié)同添加均可以支持胚胎的進(jìn)一步發(fā)育且胚胎發(fā)育質(zhì)量(即卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量)較好,FSH、GDF9對(duì)卵母細(xì)胞成熟的作用存在協(xié)同作用。第二部分抗繆勒管激素(AMH)與排卵障礙及IVF妊娠結(jié)局的相關(guān)性目的:AMH同多囊卵巢綜合癥(PCOS)和多囊卵巢形態(tài)(PCOM)之間有密切的關(guān)系,患者的AMH的表達(dá)量明顯高于正�；颊�。因此,本論文這部分對(duì)排卵障礙患者的AMH及各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,并偶聯(lián)IVF-ET結(jié)果對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)測(cè)。方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清抗繆勒管激素水平,雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH),促黃體激素(LH)、孕酮(P)和睪酮(T)在106名鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)診斷為多囊卵巢綜合征的不孕婦女(觀察組)與102名婦女懷孕前身體檢查(對(duì)照組)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。2016年12月至2017年12月因排卵障礙初次行IVF的患者50例,分別統(tǒng)計(jì)低獲卵組、中獲卵組、高獲卵組的AMH血清水平,FSH、Gn用量及獲胚數(shù)與妊娠率的差異。結(jié)果:觀察組血清中AMH、LH的激素水平均高于對(duì)照組(P0.05)。觀察組的FSH水平明顯低于對(duì)照組(P0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示血清AMH與LH(P0.05)及T、FSH(P0.05)呈正相關(guān)關(guān)系。血清AMH與E2水平無(wú)明顯關(guān)系。IVF中的低獲卵數(shù)組、正常獲卵數(shù)組和高獲卵數(shù)組之間的AMH之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IVF中的低獲卵數(shù)組低獲卵數(shù)的FSH值、Gn的用量顯著高于正常獲卵數(shù)組、高獲卵數(shù)組,獲胚數(shù)及臨床妊娠率低于正常獲卵數(shù)組、高獲卵數(shù)組(P0.05)。結(jié)論:AMH濃度與PCOS之間存在顯著的相關(guān)性,AMH可以作為評(píng)價(jià)卵巢反應(yīng)性的指標(biāo)之一,在臨床上可以指導(dǎo)醫(yī)生用促排激素的用量。不孕患者體內(nèi)AMH濃度較低時(shí),異常的AMH表達(dá)影響卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量會(huì)影響胚胎的發(fā)育及著床。第三部分IVF中異常受精卵GCs細(xì)胞的GDF9和AMH基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析目的:排卵障礙患者經(jīng)超排處理后獲得的卵母細(xì)胞成熟度不均一,分別收集經(jīng)IVF后受精正常卵的顆粒細(xì)胞和異常受精卵的顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,從而找出二者之間GDF9和AMH表達(dá)的差異及相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)。方法:分別收集卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞并編號(hào)保存,體外受精16小時(shí)后觀察受精卵情況,將2PN和(?)3PN的卵丘細(xì)胞樣本送北京諾和致源科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果:經(jīng)檢測(cè)本次數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,經(jīng)過濾后最終正常受精卵的顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為13.18G,異常受精卵的顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為10.5G。異常受精卵母細(xì)胞相比正常受精卵母細(xì)胞發(fā)生上調(diào)的基因數(shù)為693個(gè),下調(diào)的基因數(shù)為857個(gè)。GO富集分析顯示異常受精卵的顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯的降低,同時(shí)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài),AMH的表達(dá)發(fā)生顯著的下調(diào)。KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路在異常受精卵的顆粒細(xì)胞生物學(xué)作用被抑制,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育異常而多精受精。
【圖文】：

圖－Ｉ＾一邋ＡＮＧＣｖｓＮＧＣ上調(diào)差異基因的ＧＯ富集ＤＡＧ圖逡逑從上調(diào)差異基因的ＤＡＧ圖來看，生物過程的上調(diào)基因在ＡＮＧＣ上表現(xiàn)為當(dāng)逡逑細(xì)胞出現(xiàn)異�；騼�(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)，其應(yīng)對(duì)壓力會(huì)出現(xiàn)更多的未折疊蛋白及這些蛋逡逑白在細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)。細(xì)胞組分的上調(diào)基因則集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一種伴侶蛋白合逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃學(xué)鋒;張巍;;人類體外受精中的異常受精[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

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本文編號(hào)：2698609