【摘要】：研究背景:中國不孕不育發(fā)病率約占育齡人群的10%至12%,其中女方因素中的30%是由排卵障礙引起的。卵子發(fā)育是在女性的卵巢中以卵泡的形式進行,在發(fā)育過程中受著激素與生長因子的調(diào)節(jié),當發(fā)育成熟出現(xiàn)異常時會出現(xiàn)不同形式的排卵障礙。TGF-β家族是在卵母細胞成熟中重要的調(diào)節(jié)因子,研究發(fā)現(xiàn)卵子的成熟同其周圍的顆粒細胞密切相關(guān)。GDF-9和AMH同屬于TGF-β家族,不僅在卵母細胞成熟中發(fā)揮重要的作用,而且在不孕不育癥的治療與診斷等臨床方面具有重要的指標特征。本論文以GDF9和AMH為研究對象,對其在排卵障礙患者臨床應(yīng)用進行評價分析,并且對GDF9在哺乳動物卵母細胞體外培養(yǎng)成熟體系的應(yīng)用進行了探索,通過對排卵障礙病例的轉(zhuǎn)錄組進行分析,進一步揭示GDF9和AMH在卵泡的生長發(fā)育中起到的作用。第一部分 生長分化因子9(GDF-9)對卵巢功能的評價應(yīng)用目的:1對內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院進行ICSI女性患者的顆粒細胞GDF9表達進行定量分析,同患者對超排激素(主要為FSH)的敏感度進行協(xié)同分析,以期找出二者之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。2以小鼠為實驗對象,在小鼠的IVM中添加GDF9與FSH來觀察對小鼠卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響,為今后GDF9在人類的卵母細胞體外培養(yǎng)體系的應(yīng)用進行理論探索。方法:1選取2017年1月到2018年1月就診于我院行卵胞漿內(nèi)單精子注射的女性患者72例,依據(jù)取卵時獲得平均直徑14 mm的卵泡數(shù)目進行分組:卵泡數(shù)≤5個為卵巢低反應(yīng)組,6～19個為中反應(yīng)組,≥20個為高反應(yīng)組,各24例。觀察卵巢不同反應(yīng)組顆粒細胞GDF-9基因表達情況,以及GDF-9表達與排卵障礙的相關(guān)性。2將超排獲得的小鼠卵母細胞分別培養(yǎng)在M199、M199+FSH+GDF9、M199+FSH、M199+GDF9中體外成熟成熟24h小時后,體外受精并統(tǒng)計卵裂率與囊胚率。結(jié)果:1.72例IVF患者中卵巢低反應(yīng)組24例,中反應(yīng)組24例,高反應(yīng)組24例;各組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、E2水平、Gn用量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.在患者卵泡壁顆粒細胞及卵丘顆粒細胞中均有GDF-9mRNA表達,3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。低反應(yīng)組卵泡壁顆粒細胞和卵丘顆粒細胞的GDF-9mRNA相對表達量均低于中反應(yīng)組及高反應(yīng)組(均P0.05)。3.卵巢低、中、高反應(yīng)組的獲卵數(shù)分別為:(3.45±0.97)、(12.38±3.36)、(24.38±4.86)個。卵泡壁顆粒細胞、卵丘顆粒細胞GDF-9mRNA表達量與超排卵獲卵數(shù)呈正相關(guān)。4無論是單獨添加FSH、GDF9,還是協(xié)同添加FSH、GDF9,對于胚胎的卵裂率與囊胚率都極大的提升且差異顯著(P0.05)。外源性FSH和GDF9對卵母細胞的體外成熟都有著促進作用,并且這種促進作用對卵母細胞的成熟率差異不明顯(85.6%、81.5%)。單獨FSH、GDF9實驗組二者之間的囊胚率無顯著差異,單獨添加同協(xié)同添加實驗組對比差異顯著(P0.05)。結(jié)論:結(jié)果表明人類卵泡發(fā)育階段顆粒細胞與卵丘細胞也存在GDF9的表達,說明卵泡在發(fā)育階段不僅存在卵子通過旁分泌方式分泌可溶性分子調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育,而且也存在顆粒細胞與卵丘細胞通過自分泌的形式調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。不同患者的顆粒細胞GDF9表達的量同患者對外源FSH刺激的敏感度成正比。分析因為GDF9的表達調(diào)控同F(xiàn)SH保持一致,因此當患者體內(nèi)的GDF9表達量較高時,FSH的受體表達量也到了高點,此時患者對外源的FSH也可以起到最大的促進卵泡發(fā)育的作用。因此,利用GDF濃度可以作為超排效果的前期評價指標之一,可以合理的調(diào)整患者的超排與取卵方案,不僅可以節(jié)省試管嬰兒的操作流程,也可以為患者節(jié)省治療費用。體外成熟體系中單獨添加FSH、GDF9或協(xié)同添加均可以支持胚胎的進一步發(fā)育且胚胎發(fā)育質(zhì)量(即卵母細胞成熟質(zhì)量)較好,FSH、GDF9對卵母細胞成熟的作用存在協(xié)同作用。第二部分抗繆勒管激素(AMH)與排卵障礙及IVF妊娠結(jié)局的相關(guān)性目的:AMH同多囊卵巢綜合癥(PCOS)和多囊卵巢形態(tài)(PCOM)之間有密切的關(guān)系,患者的AMH的表達量明顯高于正常患者。因此,本論文這部分對排卵障礙患者的AMH及各項生理指標進行了關(guān)聯(lián)分析,并偶聯(lián)IVF-ET結(jié)果對胚胎質(zhì)量進行評測。方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清抗繆勒管激素水平,雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH),促黃體激素(LH)、孕酮(P)和睪酮(T)在106名鹿特丹標準診斷為多囊卵巢綜合征的不孕婦女(觀察組)與102名婦女懷孕前身體檢查(對照組)的數(shù)據(jù)進行比較進行了統(tǒng)計分析。2016年12月至2017年12月因排卵障礙初次行IVF的患者50例,分別統(tǒng)計低獲卵組、中獲卵組、高獲卵組的AMH血清水平,FSH、Gn用量及獲胚數(shù)與妊娠率的差異。結(jié)果:觀察組血清中AMH、LH的激素水平均高于對照組(P0.05)。觀察組的FSH水平明顯低于對照組(P0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示血清AMH與LH(P0.05)及T、FSH(P0.05)呈正相關(guān)關(guān)系。血清AMH與E2水平無明顯關(guān)系。IVF中的低獲卵數(shù)組、正常獲卵數(shù)組和高獲卵數(shù)組之間的AMH之間有統(tǒng)計學差異。IVF中的低獲卵數(shù)組低獲卵數(shù)的FSH值、Gn的用量顯著高于正常獲卵數(shù)組、高獲卵數(shù)組,獲胚數(shù)及臨床妊娠率低于正常獲卵數(shù)組、高獲卵數(shù)組(P0.05)。結(jié)論:AMH濃度與PCOS之間存在顯著的相關(guān)性,AMH可以作為評價卵巢反應(yīng)性的指標之一,在臨床上可以指導醫(yī)生用促排激素的用量。不孕患者體內(nèi)AMH濃度較低時,異常的AMH表達影響卵母細胞成熟質(zhì)量會影響胚胎的發(fā)育及著床。第三部分IVF中異常受精卵GCs細胞的GDF9和AMH基因的轉(zhuǎn)錄表達分析目的:排卵障礙患者經(jīng)超排處理后獲得的卵母細胞成熟度不均一,分別收集經(jīng)IVF后受精正常卵的顆粒細胞和異常受精卵的顆粒細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,從而找出二者之間GDF9和AMH表達的差異及相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)。方法:分別收集卵母細胞的卵丘細胞并編號保存,體外受精16小時后觀察受精卵情況,將2PN和(?)3PN的卵丘細胞樣本送北京諾和致源科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果:經(jīng)檢測本次數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,經(jīng)過濾后最終正常受精卵的顆粒細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為13.18G,異常受精卵的顆粒細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為10.5G。異常受精卵母細胞相比正常受精卵母細胞發(fā)生上調(diào)的基因數(shù)為693個,下調(diào)的基因數(shù)為857個。GO富集分析顯示異常受精卵的顆粒細胞轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯的降低,同時細胞處于應(yīng)激狀態(tài),AMH的表達發(fā)生顯著的下調(diào)。KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路在異常受精卵的顆粒細胞生物學作用被抑制,最終導致卵母細胞發(fā)育異常而多精受精。
【圖文】：

圖－Ｉ＾一邋ＡＮＧＣｖｓＮＧＣ上調(diào)差異基因的ＧＯ富集ＤＡＧ圖逡逑從上調(diào)差異基因的ＤＡＧ圖來看，生物過程的上調(diào)基因在ＡＮＧＣ上表現(xiàn)為當逡逑細胞出現(xiàn)異�；騼�(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破時，其應(yīng)對壓力會出現(xiàn)更多的未折疊蛋白及這些蛋逡逑白在細胞內(nèi)的反應(yīng)。細胞組分的上調(diào)基因則集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一種伴侶蛋白合逡逑
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃學鋒;張巍;;人類體外受精中的異常受精[J];生殖醫(yī)學雜志;2009年03期

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本文編號：2698609