【摘要】：目的:建立沉默ITIH3基因的卵巢癌細(xì)胞株Skov3-ITIH3,探索沉默該基因?qū)ζ浠熋舾行缘挠绊懠白饔眯盘柾�。方�?(1)慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的ITIH3基因表達(dá),CCK8法檢測沉默ITIH3后SKOV3耐順鉑(DDP)IC50值;實時無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA)監(jiān)測DDP對細(xì)胞的抑制隨時間變化的情況;平板克隆法檢測DDP作用細(xì)胞后,細(xì)胞克隆形成能力的變化;Western Blot檢測DDP作用時間與凋亡信號通路相關(guān)蛋白變化的關(guān)系;裸鼠皮下荷瘤模型動態(tài)分析多次腹腔注射DDP對移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)順鉑對Skov3-ITIH3 RNAi作用的IC50值較兩個對照組(Skov3、Skov3-NC)升高(p0.05),耐藥指數(shù)達(dá)2.08倍,接近體外順鉑耐藥株(Skov3/DDPII)水平;各劑量順鉑作用下Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞的CI(Cell Index)值較Skov3-NC下降緩慢,各時間點CI值均增高(p0.05);順鉑作用后,Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞克隆形成數(shù)較對照組明顯增多(p0.05);順鉑刺激下,Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1活化(p0.05),促凋亡蛋白Bak、Bim、Bax等無明顯變化趨勢,下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase9、Caspase3被抑制(p0.05),剪切的PARP蛋白減少(p0.05);裸鼠皮下荷瘤模型,隨注射DDP次數(shù)增多,Skov3-ITIH3RNAi組p-Bcl-2(Ser70、Thr56)蛋白逐漸降低,下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase9、Caspase7、Caspase3逐漸降低,剪切的PARP蛋白減少(p0.05)。結(jié)論:(1)沉默ITIH3基因能誘導(dǎo)卵巢癌Skov3細(xì)胞對順鉑的耐藥性增強(qiáng),凋亡率下降,克隆形成能力增加。其耐藥性增加可能與Bcl-2凋亡信號通路中相關(guān)蛋白改變有關(guān)。ITIH3可能是Bcl-2凋亡信號通路的上游調(diào)控蛋白。目的:研究A2M基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥的機(jī)制。方法:Western Blot檢測裸鼠移植瘤TGFβ、PARP等蛋白的相對表達(dá)量,CCK8法檢測A2M作用下細(xì)胞對順鉑的IC50值,流式細(xì)胞技術(shù)檢測A2M作用下細(xì)胞凋亡率的改變,ELISA檢測A2M作用下細(xì)胞液中TGFβ的變化,QRT-PCR檢測凋亡節(jié)點基因m RNA的相對表達(dá)量。結(jié)果:Western Blot檢測到隨順鉑注射次數(shù)增加,TGFβ、PARP、c-PARP在耐藥瘤組織的相對表達(dá)量下調(diào)。體外細(xì)胞實驗表明在A2M蛋白影響下,體外耐藥細(xì)胞株Skov3/DDPII對順鉑的IC50值下降,凋亡率升高。隨A2M濃度增加,細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ升高。細(xì)胞m RNA QRT-PCR結(jié)果表明隨A2M濃度增加,TGFβ-smad通路活化越明顯,且呈梯度變化。結(jié)論:A2M能逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑體外耐藥株Skov3/DDPII細(xì)胞的耐藥性。A2M基因是鉑類耐藥上游調(diào)控關(guān)鍵基因,其通過改變TGFβ-smad凋亡信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控了腫瘤細(xì)胞耐藥性。目的:體外分離培養(yǎng)原代卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞(OM),實驗檢測卵巢癌患者對多種常用化療藥物的敏感性和二甲雙胍的增敏效果,初步探討對卵巢癌個體化化療的應(yīng)用價值。方法:從一例初次手術(shù)卵巢癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本中分離卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RTCA對低代數(shù)(P2-P4)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)化療藥物、組合藥物及配伍藥物敏感實驗,檢測二甲雙胍的增敏效果。結(jié)果:OM體外可以持續(xù)增殖。鉑類藥物中,對細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的單藥是奈達(dá)鉑,其次為卡鉑和順鉑。化療組合中奈達(dá)鉑和多西紫杉醇聯(lián)合使用對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用最佳。二甲雙胍能增加腫瘤細(xì)胞對以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物的敏感性。結(jié)論:通過RTCA系統(tǒng)對低代數(shù)原代卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性進(jìn)行快速分析,為個體化優(yōu)選更高效的臨床化療方案提供支持。RTCA檢測分析結(jié)果可以作為判斷患者是否適用二甲雙胍作為增敏劑的依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 嘌呤霉素篩選后 100 倍鏡下 Skov3-ITIH3 RNAi 和 Skov3-NC 熒光狀態(tài)。Fig 1-1 Skov3-ITIH3 RNAi and Skov3-NC after Puromycin selection.3.2.2 Western Blot 驗證沉默效果BCA 法繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1-2），擬合方程 y=20.212x-4.2989，計算出各細(xì)胞系蛋白樣品的總蛋白含量。Western Blot 檢測各細(xì)胞中 IT蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明 Skov3-ITIH3 RNAi 細(xì)胞 ITIH3 蛋白的表達(dá)量約Skov3 和 Skov3-NC 細(xì)胞的 30%（圖 1-3），接近體外耐藥細(xì)胞株 Skov3/DD中的表達(dá)量，證實細(xì)胞株 Skov3-ITIH3 RNAi 確沉默 ITIH3 且可用于后續(xù)驗。

圖 1-2 BCA 法測量蛋白濃度的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-2 Fitting curve of protein absorbance value measured by BCA kit.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 高傳柱;王天帥;陳佳;費凡;楊波;楊健;廖霞俐;;鉑類抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年04期

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本文編號：2688042