【摘要】：目的:建立沉默ITIH3基因的卵巢癌細(xì)胞株Skov3-ITIH3,探索沉默該基因?qū)ζ浠熋舾行缘挠绊懠白饔眯盘?hào)通路。方法:(1)慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的ITIH3基因表達(dá),CCK8法檢測(cè)沉默ITIH3后SKOV3耐順鉑(DDP)IC50值;實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA)監(jiān)測(cè)DDP對(duì)細(xì)胞的抑制隨時(shí)間變化的情況;平板克隆法檢測(cè)DDP作用細(xì)胞后,細(xì)胞克隆形成能力的變化;Western Blot檢測(cè)DDP作用時(shí)間與凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化的關(guān)系;裸鼠皮下荷瘤模型動(dòng)態(tài)分析多次腹腔注射DDP對(duì)移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)順鉑對(duì)Skov3-ITIH3 RNAi作用的IC50值較兩個(gè)對(duì)照組(Skov3、Skov3-NC)升高(p0.05),耐藥指數(shù)達(dá)2.08倍,接近體外順鉑耐藥株(Skov3/DDPII)水平;各劑量順鉑作用下Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞的CI(Cell Index)值較Skov3-NC下降緩慢,各時(shí)間點(diǎn)CI值均增高(p0.05);順鉑作用后,Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞克隆形成數(shù)較對(duì)照組明顯增多(p0.05);順鉑刺激下,Skov3-ITIH3 RNAi細(xì)胞抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1活化(p0.05),促凋亡蛋白Bak、Bim、Bax等無(wú)明顯變化趨勢(shì),下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase9、Caspase3被抑制(p0.05),剪切的PARP蛋白減少(p0.05);裸鼠皮下荷瘤模型,隨注射DDP次數(shù)增多,Skov3-ITIH3RNAi組p-Bcl-2(Ser70、Thr56)蛋白逐漸降低,下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase9、Caspase7、Caspase3逐漸降低,剪切的PARP蛋白減少(p0.05)。結(jié)論:(1)沉默ITIH3基因能誘導(dǎo)卵巢癌Skov3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng),凋亡率下降,克隆形成能力增加。其耐藥性增加可能與Bcl-2凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白改變有關(guān)。ITIH3可能是Bcl-2凋亡信號(hào)通路的上游調(diào)控蛋白。目的:研究A2M基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥的機(jī)制。方法:Western Blot檢測(cè)裸鼠移植瘤TGFβ、PARP等蛋白的相對(duì)表達(dá)量,CCK8法檢測(cè)A2M作用下細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)A2M作用下細(xì)胞凋亡率的改變,ELISA檢測(cè)A2M作用下細(xì)胞液中TGFβ的變化,QRT-PCR檢測(cè)凋亡節(jié)點(diǎn)基因m RNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:Western Blot檢測(cè)到隨順鉑注射次數(shù)增加,TGFβ、PARP、c-PARP在耐藥瘤組織的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明在A2M蛋白影響下,體外耐藥細(xì)胞株Skov3/DDPII對(duì)順鉑的IC50值下降,凋亡率升高。隨A2M濃度增加,細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ升高。細(xì)胞m RNA QRT-PCR結(jié)果表明隨A2M濃度增加,TGFβ-smad通路活化越明顯,且呈梯度變化。結(jié)論:A2M能逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑體外耐藥株Skov3/DDPII細(xì)胞的耐藥性。A2M基因是鉑類耐藥上游調(diào)控關(guān)鍵基因,其通過(guò)改變TGFβ-smad凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控了腫瘤細(xì)胞耐藥性。目的:體外分離培養(yǎng)原代卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞(OM),實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌患者對(duì)多種常用化療藥物的敏感性和二甲雙胍的增敏效果,初步探討對(duì)卵巢癌個(gè)體化化療的應(yīng)用價(jià)值。方法:從一例初次手術(shù)卵巢癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本中分離卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RTCA對(duì)低代數(shù)(P2-P4)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)化療藥物、組合藥物及配伍藥物敏感實(shí)驗(yàn),檢測(cè)二甲雙胍的增敏效果。結(jié)果:OM體外可以持續(xù)增殖。鉑類藥物中,對(duì)細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的單藥是奈達(dá)鉑,其次為卡鉑和順鉑。化療組合中奈達(dá)鉑和多西紫杉醇聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用最佳。二甲雙胍能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物的敏感性。結(jié)論:通過(guò)RTCA系統(tǒng)對(duì)低代數(shù)原代卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性進(jìn)行快速分析,為個(gè)體化優(yōu)選更高效的臨床化療方案提供支持。RTCA檢測(cè)分析結(jié)果可以作為判斷患者是否適用二甲雙胍作為增敏劑的依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 嘌呤霉素篩選后 100 倍鏡下 Skov3-ITIH3 RNAi 和 Skov3-NC 熒光狀態(tài)。Fig 1-1 Skov3-ITIH3 RNAi and Skov3-NC after Puromycin selection.3.2.2 Western Blot 驗(yàn)證沉默效果BCA 法繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1-2），擬合方程 y=20.212x-4.2989，計(jì)算出各細(xì)胞系蛋白樣品的總蛋白含量。Western Blot 檢測(cè)各細(xì)胞中 IT蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明 Skov3-ITIH3 RNAi 細(xì)胞 ITIH3 蛋白的表達(dá)量約Skov3 和 Skov3-NC 細(xì)胞的 30%（圖 1-3），接近體外耐藥細(xì)胞株 Skov3/DD中的表達(dá)量，證實(shí)細(xì)胞株 Skov3-ITIH3 RNAi 確沉默 ITIH3 且可用于后續(xù)驗(yàn)。

圖 1-2 BCA 法測(cè)量蛋白濃度的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-2 Fitting curve of protein absorbance value measured by BCA kit.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 高傳柱;王天帥;陳佳;費(fèi)凡;楊波;楊健;廖霞俐;;鉑類抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年04期

2 石麗君;于紅靜;張瑋;李力;王琪;;順鉑耐藥卵巢上皮性癌細(xì)胞株及其裸鼠移植瘤模型的建立及耐藥特性探討[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2014年07期

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1 李夢(mèng)迪;A2M和CRABP2基因介導(dǎo)Fas凋亡信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

2 石麗君;卵巢癌順鉑耐藥裸鼠模型的構(gòu)建及差異因子篩選[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2688042