【摘要】：卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤,病死率一直位居?jì)D科惡性腫瘤之首。高級(jí)別漿液性卵巢癌(High-grade Serous Ovarian Cancer,HGSOC)是惡性程度最高的亞型,占卵巢癌的70%～8 0%,且具有發(fā)病隱匿、侵襲能力強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)。大多數(shù)卵巢癌患者由于缺乏特異性癥狀和早期篩查方法,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已確診為晚期,常死于腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥,晚期患者的5年生存率僅為20%～30%。因此,闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,篩選有效的分子靶點(diǎn),對(duì)于卵巢癌的早期診斷和治療具有重要意義。異常的選擇性剪接在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,腫瘤細(xì)胞通過異常的選擇性剪接產(chǎn)生有利于腫瘤增殖、凋亡、缺氧、血管生成、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移等行為的剪接異構(gòu)體,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。卵巢癌中異常剪接的分子機(jī)制與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。課題組通過轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)。與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路中,剪接體通路排在首位,進(jìn)一步分析134個(gè)主控剪接因子,發(fā)現(xiàn)有33個(gè)在卵巢癌中上調(diào),提示異常的選擇性剪接在卵巢癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。卵巢癌中存在許多基因轉(zhuǎn)錄本的差異剪接,在卵巢癌細(xì)胞中CD44s高表達(dá),CD44v低表達(dá),CD44s通過下調(diào)剪接因子ESRP1介導(dǎo)TGFβ1誘導(dǎo)的EMT通路,從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移,隨后獲得干細(xì)胞樣特征和耐藥;骨橋蛋白(OPN)轉(zhuǎn)錄本OPNc在卵巢癌中特異性表達(dá),而不是OPNa或OPNb,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、體內(nèi)腫瘤形成等惡性行為;Bcl-x是凋亡基因bcl-2家族的一員,Bcl-x基因的pre-mRNA選擇性剪接產(chǎn)生Bcl-xS和Bcl-xL,這兩種亞型分別與促進(jìn)和抑制凋亡有關(guān),Bcl-xL的過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)轉(zhuǎn)移和化療耐藥并與不良臨床預(yù)后有關(guān),而Bcl-xS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感。多聚谷氨酰胺結(jié)合蛋白 1,即PQBP1(polyglutamine binding protein 1,PQBP1)是課題組發(fā)現(xiàn)的在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)的剪接因子之一,是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的智力發(fā)育相關(guān)蛋白,其突變會(huì)導(dǎo)致X染色體相關(guān)的“Renpenning綜合征”。PQBP1與RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄因子相互作用參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。除此之外,PQBP1與多個(gè)剪接因子相互作用,參與人類細(xì)胞中許多基因mRNA的選擇性剪接。功能缺失的PQBP1降低了 SF3B1與底物mRNA的關(guān)聯(lián),導(dǎo)致選擇性剪接模式發(fā)生顯著變化。PQBP1在卵巢癌中表達(dá)水平上調(diào),但是在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮怎樣的作用,具體參與了哪些異常剪接事件,還有待進(jìn)一步研究。研究目的本課題擬明確PQBP1在HGSOC中的表達(dá);探究PQBP1在卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、凋亡等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮怎樣的作用;最后明確剪接因子PQBP1調(diào)控的下游靶基因和選擇性剪接事件。研究方法qPCR、Western blotting及免疫組化檢測卵巢癌中PQBP1的表達(dá)情況;TCGA數(shù)據(jù)庫分析表達(dá)情況及臨床預(yù)后;分子生物學(xué)方法構(gòu)建PQBP1慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒、慢病毒敲低質(zhì)粒,建立PQBP1過表達(dá)、敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系;平板克隆、MTT、EdU實(shí)驗(yàn)證明PQBP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響,Western blotting檢測周期相關(guān)蛋白的表達(dá);Transwe11實(shí)驗(yàn)探究PQBP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的影響,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測EMT通路蛋白的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測PQBP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響,Western blotting檢測凋亡蛋白的表達(dá);RT-PCR、qPCR檢測PQBP1對(duì)內(nèi)源性Bcl-x基因選擇性剪接的影響;構(gòu)建Bcl-x minigene質(zhì)粒,RT-PCR方法檢測PQBP1對(duì)外源性Bcl-x基因選擇性剪接的影響。研究結(jié)果1.PQBP1在卵巢癌中顯著高表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)課題組前期轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)剪接因子PQBP1在卵巢癌中高表達(dá)。收集正常輸卵管傘組織16例,高級(jí)別漿液性卵巢癌組織29例進(jìn)行驗(yàn)證,qPCR結(jié)果顯示PQBP1在高級(jí)別漿液性卵巢癌中普遍高表達(dá)(*P0.05),TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),卵巢癌中PQBP1存在基因擴(kuò)增及mRNA高等變異(1 1%),并且PQBP1的高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后差正相關(guān)(p=0.025)。2.PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、體內(nèi)成瘤等惡性行為利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建PQBP1高表達(dá)和低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,用于功能實(shí)驗(yàn)研究。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)PQBP1能夠明顯增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力,敲低PQBP1能夠明顯降低卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力;MTT實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)PQBP1能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖,敲低PQBP1能夠降低卵巢癌細(xì)胞增殖;檢測周期相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)敲低PQBP1的細(xì)胞p53和p21表達(dá)升高,CyclinD1、CyclinE表達(dá)下調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PQBP1在體外能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究PQBP1在卵巢癌中的生物學(xué)功能,課題組利用Transwe1l實(shí)驗(yàn)檢測PQBP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲力的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PQBP1增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞侵襲力,而敲低PQBP1則降低卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力,證明PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,增加癌細(xì)胞的惡性程度。Western blotting檢測了 EMT通路相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PQBP1促進(jìn)間質(zhì)表達(dá)相關(guān)標(biāo)記物Vimentin、P-Catenin、N-Cadherin、Claudin-1、Snail、Slug等蛋白的表達(dá),降低上皮表達(dá)相關(guān)標(biāo)記物E-Cadherin、ZO-1等蛋白的表達(dá),敲低PQBP1反之。以上結(jié)果顯示PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲及EMT進(jìn)程。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示:相比于對(duì)照組,過表達(dá)PQBP1(HEY細(xì)胞系)明顯增強(qiáng)裸鼠皮下成瘤能力,腫瘤生長速率、成瘤重量均明顯高于對(duì)照組。綜上所述,剪接因子PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及體內(nèi)成瘤能力,發(fā)揮癌基因的作用。3.PQBP1通過調(diào)控Bcl-x基因的選擇性剪接抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡Annexin/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PQBP1顯著抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡,敲低PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PQBP1促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),抑制Bax的表達(dá)。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞系中敲低PQBP1影響一系列凋亡因子的表達(dá),其中包括Bcl-x。RT-PCR檢測PQBP1影響內(nèi)源性Bcl-x基因的選擇性剪接,促進(jìn)抑凋亡轉(zhuǎn)錄本Bcl-xL的表達(dá),抑制促凋亡轉(zhuǎn)錄本Bcl-xS的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PQBP1對(duì)Bcl-x基因的調(diào)控,我們構(gòu)建了Bcl-x minigene質(zhì)粒檢測PQBP1對(duì)外源性Bcl-x基因選擇性剪接的影響,發(fā)現(xiàn)PQBP1促進(jìn)Bcl-xL的表達(dá),抑制Bcl-xS的表達(dá)。結(jié)論1.PQBP1在卵巢癌中顯著高表達(dá)并與卵巢癌患者預(yù)后差相關(guān)2.PQBP1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、體內(nèi)成瘤等惡性行為3.PQBP1調(diào)控Bcl-x基因的選擇性剪接,促進(jìn)抑凋亡轉(zhuǎn)錄本Bcl-xL的表達(dá),抑制促凋亡轉(zhuǎn)錄本Bcl-xS的表達(dá),進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡
【圖文】：

量明顯高于正常輸卵管傘組織（ＰＣ０．０５）（圖ＩＢ）。ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)逡逑ＰＱＢＰ１在ＨＧＳＯＣ中存在基因擴(kuò)增和ｍＲＮＡ高表達(dá)（１１％），進(jìn)一步分析發(fā)逡逑現(xiàn)ＰＱＢＰ１高表達(dá)的患者預(yù)后差，ＰＱＢＰ１低表達(dá)的患者預(yù)后好（圖１Ｃ）。綜逡逑上所述，ＰＱＢＰ１在高級(jí)別漿液性卵巢癌中高表達(dá)，，并且和患者預(yù)后密切相逡逑關(guān)，ＰＱＢＰ１在卵巢癌中出現(xiàn)部分?jǐn)U增、上調(diào)及點(diǎn)突變等遺傳改變。以上結(jié)逡逑果提示ＰＱＢＰ１可能在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。逡逑Ａ逡逑咖邋１邋ｍｉｍｍｍｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｍｉｍｍｉｍｉｍ＂逡逑＜逡逑Ｇｅｎｅｔｉｃ邋Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ邐｜邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋｜邋Ｄｅｅｐ邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｍＲＮＡ邋Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋■邋Ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ邋Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋■邋Ｍｉｓｓｅｎｓｅ邋Ｍｕｔａｔｉｃ逡逑Ｈｅａｔｍａｐ逡逑Ｂ邐ＰＱＢＰ１邐Ｃ邋ＴＣＧＡ邋ｏｖａｒｉａｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｍｉｃｒｏａｒｖａｙ＿ＰＱＢＰ１逡逑＇Ｉ邋寺逡逑辦邐今邐邐—１邋？？W邐｜逡逑＼Ｎ邐——邋Ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｂｏｔｔｏｍ邋ＳＣｗ逡逑八令＞邐ｇＪＬ＊、邐—邋Ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｔｏｐ邋

抗生素篩選１？２周，構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞過表達(dá)ＰＱＢＰ１穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和敲低ＰＱＢＰ１逡逑穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系各三種。ｑＰＣＲ驗(yàn)證及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測ＰＱＢＰ１表達(dá)水平，逡逑細(xì)胞系構(gòu)建成功（圖２Ａａｎｄ２Ｂ）。逡逑Ａ邋￣邋￡？邋，５ｉ邐Ａ２７８０邐￣邐ＨＯ８９１０邐２邐ＳＫＯＶ３逡逑（／）邋Ｏ邐（／）邋Ｏ邐（／｝邋Ｑ逡逑Ｑ）邋Ｑ．邐ｇ邋Ｑ＿邐邐邋０）邋Ｑ．邐＿逡逑ｉｒ°邋■邐ｍ邋劶ｒ邋幽逡逑■Ｚ邋Ｓｉ0－0Ｊ邐邐邐邋0邋ｔｏ＇ｎｊ￣．．．．．－—邐－Ｊ：邋ｔ0．0ｊ＿■■■邐邐逡逑Ｑ：邐ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ邐０＾邐ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ邐江邐ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逡逑Ａ２７８０邐ＨＯ８９１０邐ＳＫＯＶ３逡逑ＩＮＣ：邐ｓｈＰＱＢＰＩ邐ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ邐ＮＣ邋ｓｈＰＱＢＰＩ逡逑丨丨＿＿＿丨丨丨邐ＰＱＢＰ１邐ｐｑｂｐｉ邐＾ｉｈｈｉｉｐ邐ＰＱＢＰ１逡逑丨⑴丨丨…丨丨＂＿邋：：：：：邋：：—邐Ｔｕｂｕｌｉｎ邐：＿丨．丨丨＂，：丨丨丨邋｜邋＿邋：邋Ｔｕｂｕｌｉｎ邐ｍｍｍｍｍｍｍｍｍ邐Ｔｕｂｕｌｉｎ逡逑ＢＣ邐ＨＥＹ邐ｃ邐ＨＯ８９１０邐ｇ邐ＳＫＯＶ３逡逑．５邋＾３０－，邐．２邋＾２０．邐－２邋￡＊？？．邐．．．逡逑Ｕｑ邐Ｓｏ邐Ｓｑ逡逑ＩＳ＂邐Ｈ逡逑＾邋￡邋卜逡逑§＆１０－邐ｓ逡逑ｘ邋ｏ邐＾邋ａ邐ａ逡逑■３邋ｔ邋Ｏ－ｌ￣￣■邐－ｒ———邐ｆ邋色邋￣￣￣￣￣￣．邐邋ａ；邋￣￣———－ｒ－邐逡逑ＮＣ邐ＰＱＢＰ１邐Ｋ邐ＮＣ邐ＰＱＢＰ１邐＾邐ＮＣ邐ＰＱＢＰ１逡逑ｎｃＨＥｐｑｂｐ，邐１
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2685295