【摘要】：第一部分:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒的合成及其理化特性的檢測目的:制備葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒并檢測其理化性質(zhì)方法:雙乳化法合成葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒,觀察其光學(xué)形態(tài),測量包封率和載藥量、粒徑及電位分布、光學(xué)特性和穩(wěn)定性等。結(jié)果:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒形態(tài)為球形,大小均一,平均粒徑為(301.08±11.12)nm,Zeta電位為(-23.40±1.51)mv,吲哚菁綠包封率約(95.67±0.46)%、載藥量達(dá)(2.79±0.01)%,吸收光譜和熒光光譜未見明顯的波長偏移,且熒光穩(wěn)定性較游離吲哚菁綠溶液顯著提高。結(jié)論:改良的雙乳化法可成功制備葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒,并在卵巢癌的治療中有望實現(xiàn)診療一體化的新模式。第二部分:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒在體內(nèi)外的多模態(tài)成像作用目的:研究葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒作為造影劑在體內(nèi)外的多模態(tài)成像效果。方法:帶孔的瓊脂凝膠模塊用于體外部分的研究,實驗分為三組:(a)PBS對照組(control)、(b)攜氧脂質(zhì)納米粒組(ONPs)和(c)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(FA-OINPs),其中c組按不同的ICG濃度又分為8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml。808nm激光以1.5w/cm~2的強(qiáng)度輻照5分鐘,百勝超聲診斷儀分別采集激光輻照前后的超聲圖像(B超模式和造影增強(qiáng)模式),Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)采集輻照前后的光聲成像圖,最后運用相應(yīng)的圖像處理軟件定量分析結(jié)果。體內(nèi)部分利用SKOV3卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型進(jìn)行實驗,將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為兩組:(a)攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(OINPs)和(b)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(FA-OINPs),尾靜脈注射等濃度(64μg/ml)納米�；鞈乙�,利用Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)采集不同時間點裸鼠腫瘤處的光聲信號,觀察納米粒在腫瘤部位的聚集及代謝情況。另取荷瘤裸鼠隨機(jī)分為三組:(a)生理鹽水組(saline)、(b)攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(OINPs)和(c)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(FA-OINPs),尾靜脈注射相應(yīng)的溶液,6h后用808nm激光1.5w/cm~2輻照5分鐘,Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)采集注射前、輻照前、后的光聲圖像,定量分析方法同體外。結(jié)果:瓊脂凝膠模塊體外成像:與其余兩組相比,FA-OINPs組在激光輻照后的多模態(tài)成像效果較輻照前有顯著增強(qiáng)(P0.01),且該組不同濃度納米粒輻照后的B超模式、造影增強(qiáng)模式及光聲模式分別符合線性方程y=1.07x+23.51(R~2=0.92),y=0.41x-0.59(R~2=0.99)和y=0.0080x+0.21(R~2=0.93),說明激光輻照后FA-OINPs成像增強(qiáng)效果與納米粒的濃度成線性相關(guān)。荷瘤裸鼠體內(nèi)成像:FA-OINPs在注射后6h腫瘤部位光聲信號最強(qiáng),而OINPs于注射后12h達(dá)峰值,且信號強(qiáng)度弱于FA-OINPs(P0.01),說明FA-OINPs較OINPs能更快更多的聚集到腫瘤部位。激光輻照后,OINPs組PA信號增加16.39%,B超信號增加6.25%,而FA-OINPs組PA信號增加20.32%,B超信號增加13.17%。結(jié)論:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒能作為造影劑進(jìn)行超聲/光聲雙模態(tài)成像,且相較于非靶納米粒,FA-OINPs能更快更多的聚集到腫瘤部位。同時,在激光輻照后,成像效果顯著增強(qiáng),有助于實現(xiàn)卵巢癌治療的診療一體化新模式。第三部分:光聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒對卵巢癌細(xì)胞的靶向殺傷作用研究第一節(jié)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒對卵巢癌細(xì)胞體外尋靶能力的研究目的:探討葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒SKOV3卵巢癌細(xì)胞的尋靶能力。方法:取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞隨機(jī)分為OINPs組、FA-OINPs組和FA-OINPs+游離葉酸阻斷組,其中阻斷組提前用足量的葉酸封閉細(xì)胞受體。A549細(xì)胞隨機(jī)分為OINPs組和FA-OINPs組。對應(yīng)各組分別給予DiI標(biāo)記的OINPs或FA-OINPs,共孵育30分鐘,激光共聚焦顯微鏡觀察各組熒光信號。結(jié)果:SKOV3細(xì)胞中,FA-OINPs組熒光信號顯著強(qiáng)于OINPs組,表明FA-OINPs能主動靶向到SKOV3細(xì)胞并被其吞噬,而葉酸阻斷后,熒光信號顯著減弱,表明這種主動尋靶能力是由葉酸介導(dǎo)的;同時與葉酸受體低表達(dá)的A549細(xì)胞相比,FA-OINPs能更多的被葉酸受體高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞吞噬,進(jìn)一步表明FA-OINPs具有葉酸介導(dǎo)的特異性靶向能力。結(jié)論:FA-OINPs能特異性識別葉酸受體高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞,具有優(yōu)良的尋靶能力。第二節(jié)光聲激發(fā)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制目的:探究光聲激發(fā)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響和相關(guān)機(jī)制方法:用ROS試劑盒檢測SKOV3細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生情況,實驗分為7組:(a)對照組(control)、(b)光聲組(L.U.)、(c)游離吲哚菁綠+光聲組(ICG+L.U.)、(d)攜氧脂質(zhì)納米粒+光聲組(ONPs+L.U.)、(e)攜氧載吲哚菁綠納米粒+光聲組(OINPs+L.U.)、(f)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠納米粒+光聲組(FA-OINPs+L.U.)和(g)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠納米粒+光聲+乙酰基-L-半胱氨酸組(FA-OINPs+L.U.+LNAC),分別給予相應(yīng)處理后進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞隨機(jī)分為6組,同上(a)~(f),給予相應(yīng)的處理,MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率,流式細(xì)胞學(xué)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:除單獨光聲組外,其余各處理組均有活性氧產(chǎn)量的增加,其中FA-OINPs+L.U.組活性氧的產(chǎn)生量增加最明顯,為(179.46±22.46)%,顯著高于其余各處理組(P0.01);同時,該組的細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率分別為(68.94±4.83)%和(75.51±0.88)%,明顯高于其余各處理組(P0.01)。結(jié)論:光聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠納米粒能促進(jìn)SKOV3卵巢細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,降低其存活率。其機(jī)制可能與光聲動力介導(dǎo)下FA-OINPs能顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及納米粒的空化和機(jī)械效應(yīng)有關(guān)。第四部分:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒協(xié)同光聲動力對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用研究第一節(jié)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒的光輻熱效應(yīng)目的:探討激光介導(dǎo)下葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒在體內(nèi)外的光輻熱效應(yīng)。方法:48孔板用于體外光輻熱效應(yīng)的研究,SKOV3卵巢癌皮下移植瘤裸鼠用于體內(nèi)研究,實驗分為四組:(a)生理鹽水(saline)、(b)游離吲哚菁綠組(free ICG)、(c)攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒組(OINPs)和(d)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠納米粒組(FA-OINPs),808nm激光1.5w/cm~2輻照5分鐘,紅外熱成像儀系統(tǒng)記錄圖片和溫度變化。結(jié)果:體外光輻熱效應(yīng)發(fā)現(xiàn),808nm激光輻照后,生理鹽水組、游離ICG組、OINPs組和FA-OINPs組的最高溫度分別為26.8℃、41.3℃、45.6℃和47℃。與生理鹽水組相比,其余三組溫度均有顯著升高,其中OINPs組和FA-OINPs組溫度超過43℃,能對腫瘤產(chǎn)生不可逆的損傷,表明激光介導(dǎo)下納米粒具有光輻熱效應(yīng)。體內(nèi)紅外熱成像圖顯示,生理鹽水組、游離ICG組、OINPs組和FA-OINPs組,在激光輻照后,腫瘤部位的最高溫度分別為36.4℃、37.1℃、40.1℃和44.8℃,與其余三組相比,FA-OINPs的光輻熱效應(yīng)最顯著。結(jié)論:激光介導(dǎo)下葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒具有光輻熱效應(yīng),有望為腫瘤的聯(lián)合治療提供新策略。第二節(jié):葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒協(xié)同光聲動力對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用目的:探討葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒協(xié)同光聲動力對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的抑制作用及其機(jī)制。方法:將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組:(a)生理鹽水組(saline)、(b)游離吲哚菁綠+光聲組(ICG+L.U.)、(c)攜氧脂質(zhì)納米粒+光聲組(ONPs+L.U.)、(d)攜氧載吲哚菁綠納米粒+光聲組(OINPs+L.U.)和(e)葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠納米粒+光聲組(FA-OINPs+L.U.),每組8只,治療結(jié)束后第15天,每組隨機(jī)處死3只裸鼠獲取腫瘤和主要臟器,HE染色觀察納米粒的生物安全性,TUNEL檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù),VEGF及CD34檢測腫瘤微血管變化,CD68標(biāo)記葉酸受體高表達(dá)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TEMs),余下裸鼠繼續(xù)觀察記錄生存期。結(jié)果:HE染色提示各組主要臟器未見明顯的器官損傷;FA-OINPs+L.U.組腫瘤細(xì)胞凋亡率為(69.47±4.49)%,明顯高于其余各治療組(P0.05);而在CD68陽性細(xì)胞的累積光密度值(IOD)中,FA-OINPs+L.U.組顯著低于其余各組(P0.05);VEGF表達(dá)率及MVD計數(shù)提示,除游離ICG組外,其余各治療組均低于對照組(P0.05),其中FA-OINPs+L.U.組降低最明顯(P0.05)。(a)~(e)組中位生存時間依次為28,29,32,39和50天。結(jié)論:葉酸靶向攜氧載吲哚菁綠脂質(zhì)納米粒協(xié)同光聲動力能通過主動靶向作用提高納米粒載藥系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和抑制作用,延長裸鼠移植瘤模型的中位生存期。其機(jī)制可能與腫瘤乏氧微環(huán)境改善,活性氧產(chǎn)生增加,光聲介導(dǎo)下納米粒的空化機(jī)械效應(yīng)及光輻熱聯(lián)合作用有關(guān)。
【圖文】：

1.1 納米粒的結(jié)構(gòu)示意圖和大體形態(tài)圖。（a）為 FA-OINPs 納米粒結(jié)構(gòu)示意為內(nèi)核，磷脂雙分子層為外殼，ICG 包載于納米粒中。（b）FA-OINPs 混懸液乳劑。gure1.1(a)SchematicillustrationofthestructureofFA-OINPs,theoxygen-carrre, phospholipid bilayers as the shell, and ICG is encapsulated in the nanopaeral morphology of the FA-OINPs suspension is a green emulsion.

a）FA-OINPs 的光鏡圖（X400），（b）粒徑分布圖，（c）粒徑圖。 (a) The optical microscope image of FA-OINPs (X400), (b) the sy and (d) the zeta potential of FA-OINPs.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李楊;余進(jìn)洪;;液態(tài)氟碳納米粒在分子成像和靶向治療中的應(yīng)用[J];臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志;2015年08期

2 陳澄;王志剛;李攀;宮玉萍;冉海濤;;攜RGD肽的靶向相變光聲/超聲雙模態(tài)高分子造影劑的制備及體外實驗研究[J];中國超聲醫(yī)學(xué)雜志;2015年02期

3 龔小競;孟靜;陳健樺;林日強(qiáng);白曉淞;鄭加祥;宋亮;;生物醫(yī)學(xué)光聲成像技術(shù)及其臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];集成技術(shù);2013年05期

4 劉琦;;卵巢癌治療的決策[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2010年11期

5 李奧;王志剛;;液態(tài)氟碳納米粒——一種多功能影像學(xué)造影劑[J];臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志;2008年12期

，

本文編號：2685114