【摘要】：宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來,宮頸篩查的普及讓大部分宮頸癌及癌前病變得到“早發(fā)現(xiàn)早治療”,早期宮頸癌的治療效果及預(yù)后良好。但是,對于晚期或復(fù)發(fā)的宮頸癌患者,目前仍然沒有良好的治療方案和對策。血管生成是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),最近研究表明,血管生成可能成為晚期宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。目前,對于復(fù)發(fā)、晚期及轉(zhuǎn)移的宮頸癌,應(yīng)用比伐珠單抗(bevacizumab)輔助化療可改善其整體存活期中位數(shù)。但是,在沒有明確靶點(diǎn)的情況下非選擇性地使用抗血管聯(lián)合治療的臨床療效因其副作用、不良反應(yīng)及費(fèi)用過高而大打折扣。因此,進(jìn)一步探索和開發(fā)新的抗血管治療靶點(diǎn)或預(yù)測靶點(diǎn)對藥物開發(fā)具有重要意義。腫瘤微環(huán)境中血管生成作為腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),是惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵步驟之一。外泌體是細(xì)胞通過胞吐作用分泌到細(xì)胞外環(huán)境中并可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)與信息傳遞的囊泡小體,是一種新型的細(xì)胞間通訊途徑。microRNAs(miRNAs)是細(xì)胞內(nèi)22～25-nt的非轉(zhuǎn)錄單鏈RNA分子,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),具有廣泛的生物學(xué)功能,包括腫瘤血管生成。最新研究表明,腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能夠作為miRNAs的運(yùn)載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的傳送,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流和調(diào)控生物學(xué)過程。因此,進(jìn)一步探索外泌體來源miRNAs在腫瘤血管生成中的作用對開發(fā)其診療的潛在作用具有重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn),miR-221-3p在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),并且miR-221-3p的表達(dá)水平與腫瘤血管密度相關(guān)。但是miR-221-3p在宮頸癌的血管生成中的作用機(jī)制甚未明確,需要進(jìn)一步的探索和研究。因此,本課題將研究外泌體在miR-221-3p調(diào)控宮頸鱗癌血管生成中的作用及其在宮頸癌臨床診治中的潛在應(yīng)用,研究內(nèi)容分為四個(gè)部分:第一,miR-221-3p在宮頸癌中的表達(dá)及其與血管密度的關(guān)系。通過原位雜交檢測臨床宮頸癌組織標(biāo)本中miR-221-3p的表達(dá);IHC檢測CD31評估血管密度,分析miR-221-3p的表達(dá)與血管密度的相關(guān)性。結(jié)果提示miR-221-3p的表達(dá)水平與血管密度的高低呈正相關(guān),表明miR-221-3p可能對血管生成具有促進(jìn)作用。第二,外泌體介導(dǎo)miR-221-3p調(diào)控血管生成的作用。通過體外提取宮頸鱗狀細(xì)胞癌的外泌體,電鏡和WesternBlot對外泌體的性質(zhì)進(jìn)行鑒定;熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)外泌體能夠?qū)iR-221-3p轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入HUVECs;富含miR-221-3p的外泌體對HUVECs的遷移能力具有促進(jìn)作用,對HUVECs體外Matrigel成管和3D出芽的能力均具有明顯促進(jìn)作用。第三,外泌體介導(dǎo)miR-221-3p調(diào)控血管生成和腫瘤生長的作用。通過免疫缺陷小鼠皮下瘤模型及腫瘤內(nèi)注射外泌體實(shí)驗(yàn)觀察外泌體介導(dǎo)miR-221-3p對腫瘤血管生成及腫瘤生長的影響;IHC標(biāo)記腫瘤內(nèi)和腫瘤周邊的微小血管。發(fā)現(xiàn)miR-221-3p明顯促進(jìn)血管新生并促進(jìn)腫瘤的生長。第四,miR-221-3p調(diào)控血管生成的作用機(jī)制。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測PDCD1O可能是miR-221-3p的下游靶點(diǎn);miRanda數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PDCD10與miR-221-3p存在堿基互補(bǔ)位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí),miR-221-3p與PDCD1O mRNA特異性結(jié)合;miR-221-3p在HUVECs中下調(diào)PDCD10的表達(dá)。綜上,宮頸鱗狀細(xì)胞癌通過分泌外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miR-221-3p進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞,并下調(diào)PDCD10的表達(dá)水平,從而促進(jìn)血管的生成和促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋ｌ．ｌ邋Ｈ－ｓｃｏｒｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆｍｉＲ－２２１－３ｐ邋ｉｎ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑１．２．２邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宮頸及宮頸癌中的表達(dá)情況逡逑根據(jù)Ｈ－ｓｃｏｒｅ評分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（圖１－２），與正常宮頸組織相比，ｍｉＲ－２２１－３ｐ逡逑在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中年表達(dá)水平相對較高（正常宮頸３０．２７±４．０３６邋ｖｓ宮頸癌逡逑１４８．６士９．８０８．邋Ｐ＜邋０．０００１）。結(jié)果提示，ｍｉＲ－２２１－３ｐ可能與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)。逡逑Ａ邋Ｎｏｒｍａｌ邋Ｃｅｒｖｉｘ邐ＣＳＣＣ邐Ｂ邋ａ邐邐邐逡逑－＇＇ｍ邐ｉｏ逡逑圖１－２．邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宮頸及宮頸癌中的表達(dá)ａ）原位雜交結(jié)果，ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宮逡逑頸和宮頸淲狀細(xì)胞癌中的表達(dá)的典型圖片（光學(xué)顯微鏡２００ｘ）；邋ｂ）邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宮頸逡逑及宮頸癌中的表達(dá)（＊＊Ｐ＜邋０．０００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｒｖｉｘ邋ａｎｄ邋ＣＳＣＣ．邋ａ）邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ逡逑ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ｉｎ邋ｓｉｔｕ邋ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ２２１－３ｐ邋ｉｎ邋１５邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｒｖｉｘ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ逡逑４５邋ｓｑｕａｍｏｕｓ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｓａｍｐｌｅｓ．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｔ邋ｘ２００逡逑ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ

通過電鏡和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ的方法對所提取的外泌進(jìn)行鑒定。結(jié)果提不，，透逡逑射電子顯微鏡下觀察兩者形態(tài)均表現(xiàn)為典型外泌體結(jié)構(gòu)，即直徑位于４０？ｌＯＯｎｍ逡逑之間，有完整雙層脂膜包被的杯口狀的囊泡樣結(jié)構(gòu)（圖２－１Ａ）；蛋白印跡法檢測逡逑顯不Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ和Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ均表達(dá)外泌體表面標(biāo)志物ＣＩ）６３和ＣＩ）８１，形態(tài)學(xué)和逡逑分子水平證實(shí)了所提取囊泡為外泌體（圖２－１Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ邐Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ邐Ｂ邋Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ邋Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ逡逑Ｈ——卜逡逑＇＇ａＫｋ邋？邋ＣＤ８１１—邋—２６ＫＤａ逡逑ＧＡｐｐＨｉ邋ｉｍｗｈｉｉｉｉ邋３７Ｋｐａ逡逑圖２－１．宮頸癌細(xì)胞系培養(yǎng)基的外泌體的提取與鑒定ａ）電鏡觀察ＳｉｈａａｎｄＣ３３ａ細(xì)胞系外泌逡逑體的形態(tài)（標(biāo)尺＝５０邋ｎｍ）；邋ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測外泌體的標(biāo)記蛋白ＣＤ６３和ＣＤ８１，ＧＡＰＤＨ逡逑作為內(nèi)參照。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｌ＇ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌ－ｓｅｃｒｅｃｔｅｄ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．邋（ａ）逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃東寧;趙紅珊;;PDCD10,一個(gè)新的多功能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)分子[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年04期

本文編號：2683710