【摘要】：卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤。由于缺乏有效的篩查手段且早期癥狀不明顯,絕大多數(shù)患者就診時(shí)已屆晚期。大約70%患者在經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后會(huì)復(fù)發(fā),5年總體生存率僅為47%左右。漿液性卵巢癌是最常見、惡性程度高的亞型,占卵巢癌的70%左右。漿液性卵巢癌包括高級(jí)別和低級(jí)別兩種類型。高級(jí)別漿液性卵巢癌是漿液性卵巢癌中最常見的類型,其致死人數(shù)約占所有漿液性卵巢癌死亡人數(shù)的70-80%。漿液性卵巢癌發(fā)現(xiàn)晚及治療難仍然是全球面臨的難題,究其原因主要在于漿液性卵巢癌的發(fā)生及病理機(jī)制仍未闡明。2011年美國(guó)癌癥與腫瘤基因組計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)在Nature發(fā)表了卵巢癌全基因組分析成果,研究者發(fā)現(xiàn)FOXM1信號(hào)通路在87%的高級(jí)別漿液性卵巢癌中異�；罨�,僅次于TP53突變(96%)。FOXM1及其增殖相關(guān)的靶基因AURKB、CCNB1、BIRC5、CDC25和PLK1均在高級(jí)別漿液性卵巢癌中異常高表達(dá),提示FOXM1可能在漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。FOXM1是一個(gè)典型的與增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,其作為細(xì)胞有絲分裂必需成分通過(guò)調(diào)控G1-S及G2-M期轉(zhuǎn)換促進(jìn)細(xì)胞增殖。FOXM1在多種人類惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá),FOXM1可以促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化,參與腫瘤的發(fā)生,發(fā)展,包括促進(jìn)血管生成、遷移、浸潤(rùn)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞的自我更新、化療耐藥等多個(gè)過(guò)程。作為腫瘤研究中的明星分子,FOXM1在漿液性卵巢癌中異常高表達(dá)的原因及相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。在漿液性卵巢癌中FOXM1與哪些分子相互作用,通過(guò)哪些關(guān)鍵的下游靶基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等問題均未得到完全闡明。因此闡釋FOXM1異常高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其下游關(guān)鍵靶基因在漿液性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和相關(guān)分子機(jī)制對(duì)該疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷將起到至關(guān)重要的作用。本課題擬系統(tǒng)研究FOXM1通路對(duì)漿液性卵巢癌惡性行為的影響及其機(jī)制,具體研究?jī)?nèi)容包括以下三部分:第一部分FOXM1在漿液性卵巢癌中的表達(dá)、臨床意義及生物學(xué)功能研究研究目的FOXM1在乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺癌等多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)。FOXM1廣泛參與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、DNA損傷以及腫瘤干細(xì)胞的自我更新等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。本課題組漿液性卵巢癌和正常輸卵管傘表達(dá)譜芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1在漿液性卵巢癌中的表達(dá)較正常輸卵管傘中增加5.2倍。本部分旨在研究確定FOXM1在漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況,通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定FOXM1在漿液性卵巢癌中發(fā)揮的生物學(xué)功能并利用構(gòu)建的漿液性卵巢癌組織芯片免疫組化染色評(píng)價(jià)FOXM1的臨床預(yù)后價(jià)值。研究?jī)?nèi)容及方法使用Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)分析FOXM1在正常卵巢、腹膜與漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)差異。使用qRT-PCR、western blot檢測(cè)FOXM1 mRNA和蛋白在正常輸卵管傘和漿液性卵巢癌組織或者正常輸卵管傘上皮細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)。使用 TCGA、Oncomine 及 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)數(shù)據(jù)分析漿液性卵巢癌中FOXM1拷貝數(shù)對(duì)FOXM1表達(dá)的影響,同時(shí)評(píng)價(jià)FOXM1拷貝數(shù)變化對(duì)臨床預(yù)后的影響。使用TCGA數(shù)據(jù)及Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析FOXM1與漿液性卵巢癌臨床預(yù)后的關(guān)系。使用本課題組構(gòu)建的漿液性卵巢癌組織芯片的免疫組化染色確定FOXM1在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)狀況,并通過(guò)與臨床預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析確認(rèn)FOXM1在漿液性卵巢癌臨床應(yīng)用的前景。根據(jù)FOXM1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異,構(gòu)建FOXM1過(guò)表達(dá)及干擾的慢病毒載體并建立相應(yīng)的細(xì)胞系。通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及transwell功能實(shí)驗(yàn)研究FOXM1對(duì)卵巢癌細(xì)胞及輸卵管傘上皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響。利用western blot檢測(cè)FOXM1對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)分子的影響。研究結(jié)果Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)分析顯示FOXM1在漿液性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于正常卵巢或者腹膜組織。qRT-PCR結(jié)果表明FOXM1在漿液性卵巢癌組織或者卵巢癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)高于正常輸卵管傘組織或細(xì)胞。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1在漿液性卵巢癌組織或者卵巢癌細(xì)胞中蛋白表達(dá)高于正常輸卵管傘組織或細(xì)胞。FOXM1三種剪接異構(gòu)體中FOXM1C在漿液性卵巢癌中的表達(dá)最高,FOXM1B次之,FOXM1A的表達(dá)最低。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),FOXM1在11%的漿液性卵巢癌樣本中存在異�？截悢�(shù)擴(kuò)增,FOXM1拷貝數(shù)擴(kuò)增樣本較未擴(kuò)增樣本中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)均增加。Oncomine數(shù)據(jù)顯示FOXM1在漿液性卵巢癌中的拷貝數(shù)明顯高于正常卵巢組織或血液。CCLE數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在45種卵巢癌細(xì)胞中FOXM1拷貝數(shù)的變化與其mRNA和蛋白表達(dá)存在相關(guān)性。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)FOXM1拷貝數(shù)擴(kuò)增患者的總生存期及無(wú)進(jìn)展生存期低于未存在拷貝數(shù)擴(kuò)增的患者。Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析FOXM1與臨床預(yù)后關(guān)系的顯示FOXM1高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后不良。FOXM1在本課題組構(gòu)建的漿液性卵巢癌組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn):FOXM1陽(yáng)性染色分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿;FOXM1在卵巢癌中的染色強(qiáng)度高于正常輸卵管傘組織;FOXM1高表達(dá)的比例達(dá)到82.09%(110/134),FOXM1低表達(dá)的比例為17.91%(24/134),FOXM1高表達(dá)患者總生存期明顯低于FOXM1低表達(dá)患者(p0.01)。根據(jù)FOXM1在卵巢癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)構(gòu)建FOXM1過(guò)表達(dá)及干擾的細(xì)胞系。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)FOXM1后卵巢癌細(xì)胞的克隆形成、增殖及侵襲遷移的能力增強(qiáng);干擾FOXM1后卵巢癌細(xì)胞的克隆形成、生長(zhǎng)及侵襲遷移的能力明顯減弱。人輸卵管上皮細(xì)胞FTE187過(guò)表達(dá)FOXM1B后細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的能力明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明FOXM1可以明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞及輸卵管上皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HO8910細(xì)胞干擾FOXM1后E-cadherin表達(dá)上調(diào);N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug表達(dá)下降。此外,FOXM1干擾后CCNB1表達(dá)下降。研究結(jié)論FOXM1在漿液性卵巢癌中高表達(dá),與其不良臨床預(yù)后相關(guān)。FOXM1促進(jìn)漿液性卵巢癌惡性生物學(xué)行為,有望成為卵巢癌治療的重要靶點(diǎn)。第二部分漿液性卵巢癌中FOXM1下游靶基因的篩選鑒定與功能研究研究目的FOXM1在人類惡性腫瘤中表達(dá)普遍增加,FOXM1異常高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些FOXM1的靶基因,但是FOXM1驅(qū)動(dòng)的絕大多數(shù)下游靶基因仍然不清楚。由于惡性腫瘤具有極大的異質(zhì)性,單個(gè)信號(hào)通路或下游靶基因不足以解釋FOXM1促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。在漿液性卵巢癌中FOXM1通過(guò)哪些關(guān)鍵的下游靶基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等問題均未得到完全闡明。因此闡釋FOXM1下游關(guān)鍵靶基因在漿液性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和相關(guān)分子機(jī)制對(duì)該疾病的早期診斷和治療將起到至關(guān)重要的作用。本部分旨在通過(guò)ChIP-seq篩選鑒定FOXM1在漿液性卵巢癌中執(zhí)行促癌功能的關(guān)鍵下游靶基因并研究其表達(dá)、臨床意義及生物學(xué)功能。研究?jī)?nèi)容及方法通過(guò)分析文獻(xiàn)中乳腺癌細(xì)胞MCF7使用FOXM1抑制劑硫鏈絲菌素及DMSO對(duì)照后的ChIP-seq結(jié)果得到FOXM1可以結(jié)合的下游靶基因,隨后與本課題組漿液性卵巢癌表達(dá)譜芯片取交集后,初步篩選到FOXM1在漿液性卵巢癌中可能調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。使用卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建FOXM1干擾的卵巢癌細(xì)胞系,使用qRT-PCR和western blot鑒定FOXM1干擾后mRNA和蛋白水平明顯變化的下游靶基因。使用TCGA和CCLE數(shù)據(jù)分析漿液性卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中FOXM1和下游靶基因表達(dá)的相關(guān)性。使用qRT-PCR檢測(cè)漿液性卵巢癌組織中FOXM1和下游靶基因表達(dá)的相關(guān)性。利用gene-regulation網(wǎng)站分析靶基因啟動(dòng)子上FOXM1潛在結(jié)合位點(diǎn),使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究FOXM1能否直接激活靶基因表達(dá)。使用ChIP-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證FOXM1是否可以結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子上。利用qRT-PCR和western blot研究靶基因在漿液性卵巢癌臨床樣本及卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)。使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析靶基因與臨床預(yù)后的關(guān)系。使用本課題組構(gòu)建的漿液性卵巢癌組織芯片進(jìn)行免疫組化染色驗(yàn)證,結(jié)合臨床預(yù)后及臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析確認(rèn)靶基因在漿液性卵巢癌臨床應(yīng)用上的前景。通過(guò)構(gòu)建靶基因干擾或者過(guò)表達(dá)細(xì)胞系,通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)研究靶基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響。研究結(jié)果通過(guò)分析使用ChIP-seq數(shù)據(jù)及結(jié)合漿液性卵巢癌與正常輸卵管傘組織的表達(dá)譜芯片篩選到多個(gè)基因作為FOXM1在漿液性卵巢癌中可能調(diào)控的候選下游靶基因:TOP2A、TROAP、CCNA2、KIF20A、ASPM、HMGB2、CCNB1、TTF2以及CCNF。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)以上基因在漿液性卵巢癌中的表達(dá)上調(diào)。qRT-PCR及western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證后顯示卵巢癌細(xì)胞HO8910、SKOV3 和 OVCAR3 干擾 FOXM1 后 CCNF 和 KIF20A 均明顯下降。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析顯示FOXM1和CCNF表達(dá)呈中度相關(guān)(r=0.68,p0.01)。CCLE數(shù)據(jù)同樣顯示在多種卵巢癌細(xì)胞中FOXM1和CCNF的表達(dá)正相關(guān)(r=0.4096,p0.01)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1和CCNF在漿液性卵巢癌組織中的mRNA表達(dá)呈中度相關(guān)(r=0.5235,p0.01)。使用gene-regulation預(yù)測(cè)FOXM1可能結(jié)合到CCNF啟動(dòng)子上的兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示FOXM1主要通過(guò)結(jié)合到CCNF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)2(TFBS2)激活CCNF轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)1(TFBS1)發(fā)揮作用比較微弱。ChIP-PCR驗(yàn)證了 FOXM1可以直接結(jié)合CCNF啟動(dòng)子的TFBS2。qRT-PCR和western blot結(jié)果表明CCNF在漿液性卵巢癌中的mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于正常輸卵管傘組織。Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析CCNF與臨床預(yù)后的關(guān)系顯示CCNF高表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。CCNF在漿液性卵巢癌組織芯片中的免疫組化染色發(fā)現(xiàn):CCNF陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞核,CCNF高表達(dá)的比例為44.95%(49/109),CCNF高表達(dá)患者的總生存期明顯低于低表達(dá)患者(p0.05)。根據(jù)CCNF在卵巢癌細(xì)胞中的差異表達(dá)構(gòu)建CCNF過(guò)表達(dá)及干擾細(xì)胞系。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CCNF過(guò)表達(dá)后促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的克隆形成、增殖及侵襲遷移;CCNF干擾后抑制卵巢癌細(xì)胞的克隆形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。在FOXM1過(guò)表達(dá)的A2780中干擾CCNF后FOXM1促進(jìn)侵襲的能力明顯減弱。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析顯示:KIF20A在漿液性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織;FOXM1和KIF20A表達(dá)存在中度相關(guān)(r=0.66,p0.01)。CCLE數(shù)據(jù)顯示多種卵巢癌細(xì)胞中FOXM1和KIF20A表達(dá)存在相關(guān)性(r=0.3855,p0.01)。qRT-PCR的結(jié)果表明KIF20A在新鮮漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常輸卵管傘組織。The human protein atlas網(wǎng)站分析KIF20A免疫組化染色同樣證實(shí)KIF20A在卵巢癌中染色較強(qiáng),其陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞核。Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析KIF20A與臨床預(yù)后的關(guān)系顯示KIF20A高表達(dá)患者的總生存期及無(wú)進(jìn)展生存期明顯低于KIF20A低表達(dá)患者。根據(jù)KIF20A在卵巢癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)構(gòu)建KIF20A干擾的細(xì)胞系。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SKOV3及OVCAR3細(xì)胞中干擾KIF20A后卵巢癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力下降。研究結(jié)論FOXM1在漿液性卵巢癌中通過(guò)調(diào)控CCNF和KIF20A發(fā)揮促癌功能。CCNF和KIF20A在漿液性卵巢癌中高表達(dá),與其不良預(yù)后相關(guān)。第三部分FOXM1在漿液性卵巢癌中的上游分子調(diào)控機(jī)制研究研究目的可變剪接是基因調(diào)控和蛋白多樣性的主要調(diào)控機(jī)制。近些年的研究發(fā)現(xiàn)大約有95%的人類多外顯子基因存在可變剪接�？勺兗艚优c包括人類惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)。異常剪接可以導(dǎo)致抑癌基因失活或者原癌基因激活。剪接體相關(guān)因子CTNNBL1在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)其在漿液性卵巢癌中的表達(dá)明顯高于正常輸卵管傘,并且與臨床預(yù)后相關(guān)。此外,在干擾CTNNBL1前后的表達(dá)譜芯片中發(fā)現(xiàn)CTNNBL1干擾后可以影響包括FOXM1在內(nèi)的多個(gè)重要基因的可變剪接。在大約50%的人類惡性腫瘤中存在TP53突變。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)顯示TP53突變比例高達(dá)96%,FOXM1在大約87%的樣本中存在異常活化。有研究指出,野生型p53可以直接結(jié)合到FOXM1啟動(dòng)子上抑制其表達(dá)。我們由此推測(cè),漿液性卵巢癌中FOXM1異常高表達(dá)是否與突變型TP53相關(guān);野生型p53由于突變失活后對(duì)FOXM1表達(dá)的抑制作用減弱,漿液性卵巢癌中突變型p53是否通過(guò)抑制野生型p53促進(jìn)FOXM1表達(dá);漿液性卵巢癌中具有獲得性功能(Gain of function,GOF)p53突變是否可以促進(jìn)FOXM1表達(dá)。本部分的研究旨在從可變剪接和TP53調(diào)控兩個(gè)方面闡釋FOXM1在漿液性卵巢癌中高表達(dá)的原因。一方面通過(guò)研究剪接體相關(guān)因子CTNNBL1在漿液性卵巢癌中的表達(dá)、臨床意義及生物學(xué)功能及進(jìn)一步明確CTNNBL1對(duì)FOXM1可變剪接的調(diào)控機(jī)制。另一方面通過(guò)生物信息學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)初步研究TP53突變與FOXM1表達(dá)的相關(guān)性。研究?jī)?nèi)容及方法使用western blot檢測(cè)CTNNBL1在正常輸卵管傘和漿液性卵巢癌組織或卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。使用TCGA及Oncomine數(shù)據(jù)分析CTNNBL1在正常卵巢和漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)、基因變異和拷貝數(shù)差異。通過(guò)本課題組構(gòu)建的漿液性卵巢癌組織芯片免疫組化染色評(píng)價(jià)CTNNBL1表達(dá)及其與臨床預(yù)后、臨床參數(shù)的關(guān)系。使用TCGA數(shù)據(jù)分析CTNNBL1基因變異及表達(dá)及對(duì)臨床預(yù)后的影響。構(gòu)建CTNNBL1過(guò)表達(dá)或者干擾細(xì)胞系,通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究CTNNBL1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等方面的影響。使用 Affymetrix Human HTA 2.0 分析干擾 CTNNBL1 干擾前后 CTNNBL1調(diào)控的下游基因及相應(yīng)的剪接事件。構(gòu)建FOXM1迷你基因研究CTNNBL1是否可以通過(guò)調(diào)控FOXM1可變剪接的方式影響FOXM1表達(dá)。使用Oncomine及TCGA數(shù)據(jù)分析TP53與FOXM1表達(dá)的相關(guān)性。通過(guò)漿液性卵巢癌組織免疫組化染色評(píng)價(jià)p53和FOXM1表達(dá)的相關(guān)性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TP53突變后FOXM1表達(dá)的變化。研究結(jié)果Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTNNBL1蛋白在漿液性卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),其在絕大多數(shù)卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)同樣高于正常輸卵管傘上皮細(xì)胞。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析顯示:CTNNBL1 mRNA表達(dá)高于正常卵巢組織;漿液性卵巢癌中CTNNBL1 DNA拷貝數(shù)變異明顯高于正常卵巢組織;CTNNBL1拷貝數(shù)變異與其mRNA表達(dá)明顯正相關(guān)。CTNNBL1在漿液性卵巢癌組織芯片中的免疫組化染色發(fā)現(xiàn):CTNNBL1陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞核,CTNNBL1高表達(dá)的比例為56.25%(72/128),CTNNBL1高表達(dá)患者的總生存期明顯短于低表達(dá)患者(p0.05)。CTNNBL1表達(dá)與網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(p0.05)。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn):21%漿液性卵巢癌樣本存在CTNNBL1基因變異(65/316),其中16.1%(51/316)樣本是mRNA上調(diào),1%樣本是基因組拷貝數(shù)變異(3/316),CTNNBL1基因變異患者較無(wú)基因變異患者的總生存期明顯縮短;CTNNBL1高表達(dá)患者的總生存期明顯低于CTNNBL1低表達(dá)患者。平板克隆及CCK8增殖實(shí)驗(yàn)表明CTNNBL1過(guò)表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞克隆形成和增殖能力明顯增強(qiáng);干擾CTNNBL1后癌細(xì)胞的克隆形成和增殖能力明顯減弱。HO8910細(xì)胞干擾CTNNBL1后可以使細(xì)胞周期阻滯在G1期,相應(yīng)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HO8910干擾CTNNBL1后細(xì)胞周期蛋白CCND1和CCNE表達(dá)均下降。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)表明CTNNBL1過(guò)表達(dá)后促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲及遷移的能力;干擾CTNNBL1后癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力明顯減弱。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 CTNNBL1對(duì)EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響:CTNNBL1干擾后可以不同程度下調(diào)Slug、Snail、MMP2及p-catenin等分子的同時(shí)上調(diào)E-cadherin表達(dá)。剪接芯片結(jié)果顯示剪接體相關(guān)因子CTNNBL1調(diào)控包括FOXM1在內(nèi)的多種剪接事件。TCGA數(shù)據(jù)表明CTNNBL1和FOXM1表達(dá)呈正相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞中干擾CTNNBL1后FOXM1蛋白表達(dá)下降。qRT-PCR結(jié)果表明卵巢癌細(xì)胞干擾CTNNBL1后FOXM1A表達(dá)上調(diào),FOXM1B和FOXM1C表達(dá)均降低。體外剪接實(shí)驗(yàn)顯示,在HEK293T中共轉(zhuǎn)迷你基因pcDNA3.1-VIIa 和 CTNNBL1 小干擾后 FOXM1A 表達(dá)上調(diào),FOXM1B 和FOXM1C表達(dá)明顯下調(diào)。Hendrix卵巢癌數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TP53突變卵巢癌中FOXM1表達(dá)增加,免疫組化結(jié)果顯示FOXM1在p53陽(yáng)性染色卵巢癌中的表達(dá)高于p53陰性染色樣本。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn):與野生型TP53漿液性卵巢癌樣本相比,突變型TP53樣本中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)增加;具有GOF TP53突變(如R175H、R273H、R248Q、R273C、R282W、Y220C 等)漿液性卵巢癌中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)總體上高于野生型TP53樣本;具有GOF TP53突變漿液性卵巢癌樣本與未有GOF TP53樣本中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)未有明顯差異,但均高于野生型TP53樣本中的表達(dá)。本課題組關(guān)于FOXM1和TP53的漿液性卵巢癌組織的免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)FOXM1表達(dá)與p53突變相關(guān)(p0.01)。Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用 TP53 siRNA 干擾 A2780(p53 wild type)后FOXM1蛋白表達(dá)相應(yīng)升高,而使用nutlin3a激活p53后FOXM1蛋白表達(dá)相應(yīng)下降。qRT-PCR檢測(cè)SKOV3(p53 null)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)突變及野生型TP53后,除TP53突變(R248Q)外FOXM1mRNA表達(dá)與對(duì)照組未有明顯差異。但是western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SKOV3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)突變及野生型TP53后,突變型TP53(R248Q和R282W)細(xì)胞中FOXM1蛋白表達(dá)增加。研究結(jié)論CTNNBL1通過(guò)調(diào)控FOXM1的可變剪接影響其表達(dá)。FOXM1在漿液性卵巢癌中高表達(dá)與TP53突變相關(guān)。
【圖文】：

圖３．生存分析顯示ＦＯＸＭＩ表達(dá)與漿液性卵巢癌的臨床預(yù)后相關(guān)逡逑（Ａ）邋ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)分析ＦＯＸＭ１拷貝數(shù)擴(kuò)增對(duì)患者總生存期的影響。（Ｂ）逡逑ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)分析ＦＯＸＭ１拷貝數(shù)擴(kuò)增對(duì)患者無(wú)進(jìn)展生存期的影響。（Ｃ）逡逑Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ邋Ｐｌｏｔｔｅｒ網(wǎng)站分析卵巢癌中ＦＯＸＭ１表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系。逡逑

圖４．邋ＦＯＸＭ１促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的克隆形成及生長(zhǎng)逡逑（Ａ－Ｂ）平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＦＯＸＭ１對(duì)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。逡逑（Ｃ－Ｄ）邋ＣＣＫ８增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＦＯＸＭ１對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。＊ｐ＜０．０５，，逡逑＊＊＾＜０．０１邋0逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31


本文編號(hào)：2682782