【摘要】：鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是世界范圍內(nèi)使用最廣泛的塑化劑,在環(huán)境中無(wú)處不在。DEHP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),具有男性生殖發(fā)育毒性,孕期DEHP暴露可引起雄性子代睪丸的發(fā)育損傷,肛門與生殖器間距離(anogenital distance,AGD)減小和血清睪酮含量降低。近年來(lái),越來(lái)越多的研究證據(jù)表明孕期DEHP暴露與出生體重的降低有關(guān),但人群流行病學(xué)結(jié)果尚存在爭(zhēng)議性,并且孕期DEHP暴露的作用敏感期尚未明確,是否存在性別差異性也不得而知,潛在的胎盤機(jī)制尚未研究,為解決以上問(wèn)題,我們首先研究一建立小鼠孕期DEHP暴露模型,探討孕期DEHP暴露對(duì)仔鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響,并明確其致子代宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth restriction,IUGR)的敏感期;隨后研究孕期DEHP暴露對(duì)小鼠胎盤甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,THR)信號(hào)和胎盤血管生成的影響;最后,結(jié)合人群病例對(duì)照研究的結(jié)果,闡明甲狀腺激素受體信號(hào)在孕期DEHP暴露致IUGR中的作用及機(jī)制。同時(shí),孕期DEHP暴露對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育的影響也越來(lái)越受到人們的關(guān)注,研究證據(jù)表明孕期DEHP暴露損傷嬰幼兒期、青春期甚至成年期子代的神經(jīng)行為發(fā)育,但對(duì)老年期的神經(jīng)行為是否有影響,尚不可知。為此,研究二建立小鼠孕期DEHP暴露模型,通過(guò)一系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)子代在老年期的神經(jīng)行為表現(xiàn),明確孕期DEHP暴露對(duì)子代神經(jīng)行為發(fā)育的遠(yuǎn)期效應(yīng)。本次研究明確了孕期DEHP暴露的發(fā)育毒性及其作用的關(guān)鍵期,探討了潛在胎盤機(jī)制,并揭示了孕期DEHP對(duì)子代神經(jīng)行為的遠(yuǎn)期效應(yīng)。研究一母體孕期DEHP暴露致子代宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的胎盤機(jī)制目的探討是否孕期DEHP暴露以性別特異性的方式導(dǎo)致IUGR發(fā)生,明確DEHP致胎兒IUGR的關(guān)鍵期,探索潛在的胎盤機(jī)制。方法為探討孕期DEHP暴露對(duì)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響,孕鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組,低劑量暴露組(50 mg/kg/day)和高劑量組(200 mg/kg/day),孕全程(GD0-GD17)給予DEHP灌胃處理,于GD18剖殺全部孕鼠,記錄每窩吸收胎、死胎和活胎數(shù),辨別活胎雌雄并測(cè)量體重和身長(zhǎng),記錄胎盤重;收集母鼠血清和胎鼠血清,電化學(xué)免疫發(fā)光發(fā)檢測(cè)血清甲狀腺激素(thyroid hormones,THs)水平;為探討不同孕期DEHP暴露對(duì)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響,孕鼠隨機(jī)分為3組:孕早期暴露組(GD0-GD6),孕中期暴露組(GD7-GD12)和孕晚期暴露組(GD13-GD17),劑量選擇為200 mg/kg/day,在不同孕期每天給予孕鼠灌胃處理。GD18剖殺孕鼠,記錄每窩吸收胎、死胎和活胎數(shù),辨別活胎雌雄,并測(cè)量活胎體重和身長(zhǎng);為探討孕期DEHP暴露致子代IUGR的潛在胎盤機(jī)制,孕鼠隨機(jī)分為3組,從GD0-GD14給予孕鼠DEHP灌胃處理(0,50或200 mg/kg/day),GD15剖殺孕鼠,收集母鼠血清和胎盤,部分胎盤用于總RNA提取,驗(yàn)證胎盤THR、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵和胎盤相關(guān)生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)水平,部分胎盤用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)THR的核轉(zhuǎn)位水平,部分胎盤用于組織病理學(xué)檢測(cè),HE染色比較各組胎盤迷路層血竇面積,免疫組織化學(xué)法比較各組胎盤迷路層微血管密度。人群病例對(duì)照研究以馬鞍山優(yōu)生優(yōu)育隊(duì)列為依托,免疫組織化學(xué)法比較小于胎齡兒組(small for gestational age,SGA)和適于胎齡兒組(appropriate for gestational age,AGA)胎盤微血管密度和滋養(yǎng)細(xì)胞甲狀腺激素受體表達(dá)情況。結(jié)果孕期DEHP暴露對(duì)母鼠飼料消耗量和體重增長(zhǎng)沒(méi)有影響,孕期DEHP暴露引起仔鼠出生體重和身長(zhǎng)顯著降低,暴露組平均每窩IUGR發(fā)生率顯著升高,對(duì)照組發(fā)生率為8.9%,低劑量組為28.6%,高劑量組為67.7%,呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系;分性別進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),DEHP處理組雄鼠體重和身長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組,處理組雌鼠的體重和身長(zhǎng)也顯著低于對(duì)照組,不存在性別差異;在不同孕期給予母體DEHP暴露結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同孕期DEHP暴露對(duì)飼料消耗量和體重增長(zhǎng)都沒(méi)有影響。按暴露孕期進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)孕早期暴露并不影響仔鼠體重,孕中期暴露稍降低仔鼠體重和身長(zhǎng),孕晚期暴露顯著降低仔鼠體重和身長(zhǎng),同樣也不存在性別特異性,這些結(jié)果表明孕期DEHP暴露可致子代IUGR,不存在性別特異性,孕中期和孕晚期是其作用的關(guān)鍵期;電化學(xué)免疫發(fā)光結(jié)果表明孕期DEHP暴露對(duì)母鼠和仔鼠血清中甲狀腺激素水平?jīng)]有影響;孕期DEHP暴露明顯下調(diào)胎盤甲狀腺激素受體Thrα1和Thrβ1基因表達(dá),并顯著抑制THRα1和THRβ1的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位;孕期DEHP暴露顯著下調(diào)胎盤Pgf,Vegf和Igf等甲狀腺激素受體下游基因的表達(dá);各組之間胎盤重量沒(méi)有差別,但DEHP處理組的胎盤迷路層血竇面積顯著縮小,且迷路層微血管密度顯著降低;胎盤物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵(Glut1和Fatp1)基因的表達(dá)在DEHP處理組小鼠也是下調(diào)的;病例對(duì)照研究結(jié)果表明,SGA組胎盤微血管密度顯著低于AGA組,甲狀腺激素受體THRα1和THRβ1的蛋白表達(dá)豐度也顯著低于AGA組。結(jié)論孕期DEHP暴露可導(dǎo)致子代IUGR,無(wú)性別差異性,但存在明顯窗口期;孕期DEHP暴露通過(guò)干擾甲狀腺激素受體信號(hào),造成胎盤血管生成障礙,從而導(dǎo)致子代IUGR。研究二孕期DEHP暴露對(duì)子代體格和神經(jīng)行為的遠(yuǎn)期效應(yīng)目的探討孕期DEHP暴露對(duì)子代體格發(fā)育和神經(jīng)行為的遠(yuǎn)期影響。方法孕鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照組,孕中期暴露組(GD7-GD12)和孕晚期暴露組(GD13-GD18),劑量選擇為200 mg/kg/day。自然分娩后,辨別仔鼠雌雄,稱量每窩所有仔鼠體重,并將窩別大小調(diào)整為10只小鼠(5只雌鼠和5只雄鼠),出生后第21天進(jìn)行斷乳,按照孕期處理和性別進(jìn)行分籠飼養(yǎng),每周記錄體重;進(jìn)入老年期后,進(jìn)行一系列的行為學(xué)實(shí)驗(yàn),曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠焦慮狀態(tài),糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠抑郁狀態(tài),Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能。結(jié)果孕晚期DEHP暴露顯著降低仔鼠出生體重,并觀察到明顯的追趕性生長(zhǎng),沒(méi)有性別差異,斷乳時(shí),各組體重之間沒(méi)有差別,成年時(shí),各組體重之間沒(méi)有差別,老年期時(shí),各組體重之間也沒(méi)有差別,表明孕期DEHP暴露對(duì)子代體格發(fā)育沒(méi)有遠(yuǎn)期效應(yīng);老年期時(shí)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕晚期而非孕中期DEHP暴露顯著增加雄性小鼠的焦慮樣行為,表現(xiàn)為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間縮短和進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少,高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)減少和在開(kāi)臂停留時(shí)間縮短;孕晚期而非孕中期DEHP暴露顯著增加雄性小鼠的抑郁樣行為,表現(xiàn)為強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng),但在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中各組之間糖水偏愛(ài)指數(shù)沒(méi)有差別;孕中期而非孕晚期DEHP暴露顯著損傷雄鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能,表現(xiàn)為Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中訓(xùn)練期逃跑潛伏期延長(zhǎng),測(cè)試期時(shí)穿越平臺(tái)次數(shù)減少和在目標(biāo)象限中總運(yùn)動(dòng)距離縮短;然而,孕期DEHP暴露對(duì)雌鼠的焦慮和抑郁樣行為以及空間學(xué)習(xí)和記憶功能都沒(méi)有影響。結(jié)論孕期DEHP暴露損傷老年小鼠神經(jīng)行為,存在明顯的性別依賴性和孕期特異性�？偨Y(jié)論綜合研究一和研究二的結(jié)果,得出以下3個(gè)結(jié)論:(1)孕期DEHP暴露導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限,無(wú)性別依賴性,存在作用敏感期;(2)孕期DEHP暴露通過(guò)干擾胎盤甲狀腺激素受體信號(hào),阻礙胎盤血管生成,從而導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限;(3)孕期DEHP暴露損傷老年鼠神經(jīng)行為,存在明顯的性別依賴性和孕期特異性。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文litter, live fetuses per litter, dead fetuses per litter, total sex ratio were analyzed using one-wayANOVA followed by SNK. The result of resorptions per litter and IUGR incidence per litter wasanalyzed using nonparametric tests and average sex ratio was analyzed using chi-square test.Quantified data are represented as means ± SEM. As compared with control group, * p<0.05, **p<0.001.As compared with low-dose group, # p<0.05, ## p<0.001.

4.5 孕期 DEHP 暴露致 IUGR 胎盤機(jī)制的探討4.5.1 孕期 DEHP 暴露對(duì)母體和仔鼠甲狀腺激素水平的影響本研究探討了孕期 DEHP 暴露對(duì)母體和仔鼠甲狀腺激素水平的影響，采化學(xué)免疫發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖 2 所示：無(wú)論是低劑量或高劑量 暴露，均沒(méi)有影響 GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT3的水平，GD15 和 GD18血清中 TT3的水平相近；同樣，無(wú)論是低劑量或高劑量 DEHP 暴露，均沒(méi)有GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT4的水平，GD15 和 GD18 母體血清中 TT4的相近；對(duì)仔鼠血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)： DEHP 暴露沒(méi)有引起仔鼠血清中 TT3和 TT4濃改變。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)仔鼠血清中 TT3的濃度約是 GD15 和 GD18 母體血TT3濃度的兩倍。這些結(jié)果表明，孕期 DEHP 暴露對(duì)母體和胎兒血清甲狀腺激平?jīng)]有影響，至少在本次實(shí)驗(yàn)的 DEHP 暴露劑量下沒(méi)有影響。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R715.3

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本文編號(hào)：2682079