【摘要】：鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是世界范圍內使用最廣泛的塑化劑,在環(huán)境中無處不在。DEHP是一種典型的內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),具有男性生殖發(fā)育毒性,孕期DEHP暴露可引起雄性子代睪丸的發(fā)育損傷,肛門與生殖器間距離(anogenital distance,AGD)減小和血清睪酮含量降低。近年來,越來越多的研究證據(jù)表明孕期DEHP暴露與出生體重的降低有關,但人群流行病學結果尚存在爭議性,并且孕期DEHP暴露的作用敏感期尚未明確,是否存在性別差異性也不得而知,潛在的胎盤機制尚未研究,為解決以上問題,我們首先研究一建立小鼠孕期DEHP暴露模型,探討孕期DEHP暴露對仔鼠宮內生長發(fā)育的影響,并明確其致子代宮內生長受限(intrauterine growth restriction,IUGR)的敏感期;隨后研究孕期DEHP暴露對小鼠胎盤甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,THR)信號和胎盤血管生成的影響;最后,結合人群病例對照研究的結果,闡明甲狀腺激素受體信號在孕期DEHP暴露致IUGR中的作用及機制。同時,孕期DEHP暴露對子代神經發(fā)育的影響也越來越受到人們的關注,研究證據(jù)表明孕期DEHP暴露損傷嬰幼兒期、青春期甚至成年期子代的神經行為發(fā)育,但對老年期的神經行為是否有影響,尚不可知。為此,研究二建立小鼠孕期DEHP暴露模型,通過一系列行為學實驗檢測子代在老年期的神經行為表現(xiàn),明確孕期DEHP暴露對子代神經行為發(fā)育的遠期效應。本次研究明確了孕期DEHP暴露的發(fā)育毒性及其作用的關鍵期,探討了潛在胎盤機制,并揭示了孕期DEHP對子代神經行為的遠期效應。研究一母體孕期DEHP暴露致子代宮內生長受限的胎盤機制目的探討是否孕期DEHP暴露以性別特異性的方式導致IUGR發(fā)生,明確DEHP致胎兒IUGR的關鍵期,探索潛在的胎盤機制。方法為探討孕期DEHP暴露對胎兒宮內生長發(fā)育的影響,孕鼠隨機分為3組:對照組,低劑量暴露組(50 mg/kg/day)和高劑量組(200 mg/kg/day),孕全程(GD0-GD17)給予DEHP灌胃處理,于GD18剖殺全部孕鼠,記錄每窩吸收胎、死胎和活胎數(shù),辨別活胎雌雄并測量體重和身長,記錄胎盤重;收集母鼠血清和胎鼠血清,電化學免疫發(fā)光發(fā)檢測血清甲狀腺激素(thyroid hormones,THs)水平;為探討不同孕期DEHP暴露對胎兒宮內生長發(fā)育的影響,孕鼠隨機分為3組:孕早期暴露組(GD0-GD6),孕中期暴露組(GD7-GD12)和孕晚期暴露組(GD13-GD17),劑量選擇為200 mg/kg/day,在不同孕期每天給予孕鼠灌胃處理。GD18剖殺孕鼠,記錄每窩吸收胎、死胎和活胎數(shù),辨別活胎雌雄,并測量活胎體重和身長;為探討孕期DEHP暴露致子代IUGR的潛在胎盤機制,孕鼠隨機分為3組,從GD0-GD14給予孕鼠DEHP灌胃處理(0,50或200 mg/kg/day),GD15剖殺孕鼠,收集母鼠血清和胎盤,部分胎盤用于總RNA提取,驗證胎盤THR、營養(yǎng)物質轉運泵和胎盤相關生長因子的基因表達水平,部分胎盤用于蛋白印跡實驗,檢測THR的核轉位水平,部分胎盤用于組織病理學檢測,HE染色比較各組胎盤迷路層血竇面積,免疫組織化學法比較各組胎盤迷路層微血管密度。人群病例對照研究以馬鞍山優(yōu)生優(yōu)育隊列為依托,免疫組織化學法比較小于胎齡兒組(small for gestational age,SGA)和適于胎齡兒組(appropriate for gestational age,AGA)胎盤微血管密度和滋養(yǎng)細胞甲狀腺激素受體表達情況。結果孕期DEHP暴露對母鼠飼料消耗量和體重增長沒有影響,孕期DEHP暴露引起仔鼠出生體重和身長顯著降低,暴露組平均每窩IUGR發(fā)生率顯著升高,對照組發(fā)生率為8.9%,低劑量組為28.6%,高劑量組為67.7%,呈現(xiàn)明顯劑量-效應關系;分性別進行分析發(fā)現(xiàn),DEHP處理組雄鼠體重和身長顯著低于對照組,處理組雌鼠的體重和身長也顯著低于對照組,不存在性別差異;在不同孕期給予母體DEHP暴露結果發(fā)現(xiàn),不同孕期DEHP暴露對飼料消耗量和體重增長都沒有影響。按暴露孕期進行分析發(fā)現(xiàn)孕早期暴露并不影響仔鼠體重,孕中期暴露稍降低仔鼠體重和身長,孕晚期暴露顯著降低仔鼠體重和身長,同樣也不存在性別特異性,這些結果表明孕期DEHP暴露可致子代IUGR,不存在性別特異性,孕中期和孕晚期是其作用的關鍵期;電化學免疫發(fā)光結果表明孕期DEHP暴露對母鼠和仔鼠血清中甲狀腺激素水平沒有影響;孕期DEHP暴露明顯下調胎盤甲狀腺激素受體Thrα1和Thrβ1基因表達,并顯著抑制THRα1和THRβ1的細胞核轉位;孕期DEHP暴露顯著下調胎盤Pgf,Vegf和Igf等甲狀腺激素受體下游基因的表達;各組之間胎盤重量沒有差別,但DEHP處理組的胎盤迷路層血竇面積顯著縮小,且迷路層微血管密度顯著降低;胎盤物質轉運泵(Glut1和Fatp1)基因的表達在DEHP處理組小鼠也是下調的;病例對照研究結果表明,SGA組胎盤微血管密度顯著低于AGA組,甲狀腺激素受體THRα1和THRβ1的蛋白表達豐度也顯著低于AGA組。結論孕期DEHP暴露可導致子代IUGR,無性別差異性,但存在明顯窗口期;孕期DEHP暴露通過干擾甲狀腺激素受體信號,造成胎盤血管生成障礙,從而導致子代IUGR。研究二孕期DEHP暴露對子代體格和神經行為的遠期效應目的探討孕期DEHP暴露對子代體格發(fā)育和神經行為的遠期影響。方法孕鼠隨機分為3組,對照組,孕中期暴露組(GD7-GD12)和孕晚期暴露組(GD13-GD18),劑量選擇為200 mg/kg/day。自然分娩后,辨別仔鼠雌雄,稱量每窩所有仔鼠體重,并將窩別大小調整為10只小鼠(5只雌鼠和5只雄鼠),出生后第21天進行斷乳,按照孕期處理和性別進行分籠飼養(yǎng),每周記錄體重;進入老年期后,進行一系列的行為學實驗,曠場實驗和高架十字迷宮實驗檢測小鼠焦慮狀態(tài),糖水偏好實驗和強迫游泳實驗檢測小鼠抑郁狀態(tài),Morris水迷宮實驗檢測小鼠空間學習和記憶功能。結果孕晚期DEHP暴露顯著降低仔鼠出生體重,并觀察到明顯的追趕性生長,沒有性別差異,斷乳時,各組體重之間沒有差別,成年時,各組體重之間沒有差別,老年期時,各組體重之間也沒有差別,表明孕期DEHP暴露對子代體格發(fā)育沒有遠期效應;老年期時行為學檢測結果發(fā)現(xiàn)孕晚期而非孕中期DEHP暴露顯著增加雄性小鼠的焦慮樣行為,表現(xiàn)為曠場實驗中在中央?yún)^(qū)停留時間縮短和進入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少,高架十字迷宮實驗中進入開臂次數(shù)減少和在開臂停留時間縮短;孕晚期而非孕中期DEHP暴露顯著增加雄性小鼠的抑郁樣行為,表現(xiàn)為強迫游泳實驗中不動時間延長,但在糖水偏好實驗中各組之間糖水偏愛指數(shù)沒有差別;孕中期而非孕晚期DEHP暴露顯著損傷雄鼠的空間學習和記憶功能,表現(xiàn)為Morris水迷宮實驗中訓練期逃跑潛伏期延長,測試期時穿越平臺次數(shù)減少和在目標象限中總運動距離縮短;然而,孕期DEHP暴露對雌鼠的焦慮和抑郁樣行為以及空間學習和記憶功能都沒有影響。結論孕期DEHP暴露損傷老年小鼠神經行為,存在明顯的性別依賴性和孕期特異性�？偨Y論綜合研究一和研究二的結果,得出以下3個結論:(1)孕期DEHP暴露導致胎兒宮內生長受限,無性別依賴性,存在作用敏感期;(2)孕期DEHP暴露通過干擾胎盤甲狀腺激素受體信號,阻礙胎盤血管生成,從而導致胎兒宮內生長受限;(3)孕期DEHP暴露損傷老年鼠神經行為,存在明顯的性別依賴性和孕期特異性。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學博士學位論文litter, live fetuses per litter, dead fetuses per litter, total sex ratio were analyzed using one-wayANOVA followed by SNK. The result of resorptions per litter and IUGR incidence per litter wasanalyzed using nonparametric tests and average sex ratio was analyzed using chi-square test.Quantified data are represented as means ± SEM. As compared with control group, * p<0.05, **p<0.001.As compared with low-dose group, # p<0.05, ## p<0.001.

4.5 孕期 DEHP 暴露致 IUGR 胎盤機制的探討4.5.1 孕期 DEHP 暴露對母體和仔鼠甲狀腺激素水平的影響本研究探討了孕期 DEHP 暴露對母體和仔鼠甲狀腺激素水平的影響，采化學免疫發(fā)光法進行檢測分析，結果如圖 2 所示：無論是低劑量或高劑量 暴露，均沒有影響 GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT3的水平，GD15 和 GD18血清中 TT3的水平相近；同樣，無論是低劑量或高劑量 DEHP 暴露，均沒有GD15 和 GD18 的母鼠血清中 TT4的水平，GD15 和 GD18 母體血清中 TT4的相近；對仔鼠血清檢測發(fā)現(xiàn)： DEHP 暴露沒有引起仔鼠血清中 TT3和 TT4濃改變。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)仔鼠血清中 TT3的濃度約是 GD15 和 GD18 母體血TT3濃度的兩倍。這些結果表明，孕期 DEHP 暴露對母體和胎兒血清甲狀腺激平沒有影響，至少在本次實驗的 DEHP 暴露劑量下沒有影響。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R715.3

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本文編號：2682079