【摘要】：第一部分miR-210對(duì)EVT的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)的作用目的通過(guò)調(diào)節(jié)miR-210在人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá),觀察其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖,遷移,侵襲,凋亡及小管形成能力的影響,探討miR-210對(duì)EVT的生物學(xué)功能的影響。方法1、采用原位雜交技術(shù)對(duì)miR-210在早孕期絨毛組織及母體蛻膜組織的表達(dá)進(jìn)行定位;2、在HTR-8/SVneo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-210 mimic以增強(qiáng)miR-210的表達(dá),同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-210 mimic NC作為陰性對(duì)照,qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞的miR-210的表達(dá);3、在HTR-8/SVneo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor以減弱miR-210的表達(dá),同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor NC作為陰性對(duì)照,qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞的miR-210的表達(dá);4、CCK-8法測(cè)定轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力;5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞的凋亡能力;6、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力;7、小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞的小管形成能力;8、qRT-PCR和Western Blot分別從RNA和蛋白水平檢測(cè)兩組細(xì)胞MMP2、Bcl-2、BAX、VEGF-A、PIGF的表達(dá)。結(jié)果1、miR-210在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜EVT中均有表達(dá),且蛻膜EVT中miR-210的表達(dá)水平低于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞。2、與miR-210 mimic NC相比,miR-210 mimic組miR-210的表達(dá)水平明顯升高;且細(xì)胞的增殖,遷移,侵襲,小管形成能力均減弱,而細(xì)胞的凋亡能力增強(qiáng);同時(shí)MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表達(dá)水平均下降,BAX在m RNA及蛋白表達(dá)水平均升高,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表達(dá)均下降;3、與miR-210 inhibitor NC相比,miR-210 inhibitor組miR-210的表達(dá)水平明顯下降;且細(xì)胞的增殖,遷移,侵襲,小管形成能力均增強(qiáng),而細(xì)胞的凋亡能力減弱;同時(shí)MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表達(dá)水平均升高,BAX在m RNA及蛋白表達(dá)水平均下降,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表達(dá)均升高;結(jié)論調(diào)節(jié)miR-210的表達(dá)可改變HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖,遷移,侵襲,凋亡及小管形成能力,表明miR-210對(duì)EVT的生物學(xué)功能具有調(diào)控作用。第二部分miR-210調(diào)控Notch1的表達(dá)介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移與侵襲功能目的探討miR-210調(diào)控NOTCH1介導(dǎo)的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的作用及其分子機(jī)制。方法1、qRT-PCR和Western Blot分別從RNA和蛋白水平檢測(cè)子癇前期患者胎盤(pán)組織與同期正常孕婦的胎盤(pán)組織中的NOTCH1的表達(dá);同時(shí)檢測(cè)其中miR-210的m RNA表達(dá)水平;2、采用IHC法對(duì)早孕絨毛組織及蛻膜進(jìn)行NOTCH1的表達(dá)定位;3、實(shí)驗(yàn)分組sh-NOTCH1:轉(zhuǎn)染NOTCH1沉默質(zhì)粒至HTR-8/SVneo細(xì)胞,對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組為scramble sh RNA(sh-Scb);miR-210 mimic:轉(zhuǎn)染miR-210 mimic至HTR-8/SVneo細(xì)胞,對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組為miR-210 mimic NC;miR-210 inhibitor:轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor至HTR-8/SVneo細(xì)胞,對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組為miR-210 inhibitor NC;miR-210 inhibitor NC+sh-NOTCH1:將miR-210敲低陰性對(duì)照組與NOTCH1沉默質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細(xì)胞;miR-210 inhibitor+sh-NOTCH1:將miR-210敲低組與NOTCH1沉默質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細(xì)胞;4、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-210對(duì)NOTCH1的調(diào)節(jié)作用;5、Transwell實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力;結(jié)果1、與正常胎盤(pán)組織相比,子癇前期患者胎盤(pán)組織中miR-210的表達(dá)水平升高,而NOTCH1的表達(dá)水平降低;且在子癇前期患者的胎盤(pán)組織中,miR-210與NOTCH1在m RNA水平的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系;2、NOTCH1在絨毛及蛻膜組織中滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá),且在蛻膜組中的表達(dá)增強(qiáng);3、下調(diào)NOTCH1的表達(dá),HTR-8/SVneo細(xì)胞中NOTCH1在m RNA及蛋白水平均表達(dá)下降,同時(shí)細(xì)胞的遷移及侵襲能力減弱;4、上調(diào)miR-210的表達(dá)會(huì)減弱HTR-8/SVneo細(xì)胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同時(shí)細(xì)胞的遷移及侵襲能力均減弱;5、下調(diào)miR-210的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同時(shí)細(xì)胞的遷移及侵襲能力均升高;若同時(shí)共轉(zhuǎn)染NOTCH1沉默質(zhì)粒,NOTCH1表達(dá)水平與對(duì)照組相比,幾乎不受影響,且HTR-8/SVneo細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力恢復(fù)至對(duì)照組水平;結(jié)論miR-210可減弱NOTCH1的表達(dá),抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力,可能是子宮螺旋動(dòng)脈障礙的重要調(diào)控機(jī)制。
【圖文】：

圖 1-2 qRT-PCR 檢測(cè) miR-210 的相對(duì)表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)組 HTR-8/SVneo 細(xì)胞miR-210 的 RNA 水平顯著高于陰性對(duì)照組（*：P＜0.05），而抑制組 HTR-8/SVneo細(xì)胞 miR-210 的 RNA 水平顯著低于陰性對(duì)照組（***：P＜0.001）。三、miR-210 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響①細(xì)胞增殖能力比較CCK-8 法檢測(cè) miR-210 對(duì) HTR-8/SVneo 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-3。與 miR-210 mimic NC 組相比，miR-210 mimic 組細(xì)胞的增殖能力顯著減弱（1.16±0.05 vs 0.88±0.04, p<0.01）。而與 miR-210 inhibitor NC 組相比，miR-210inhibitor 組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（0.94±0.02 vs 1.07±0.03, p<0.05）。②細(xì)胞凋亡能力比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) miR-210 對(duì) HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-3。與 miR-210 mimic NC 組相比，miR-210 mimic 組細(xì)胞的凋亡能力增強(qiáng)（5.52±0.16 vs 12.36±0.10, p<0.001），，Bcl-2的mRNA（1.14±0.14 vs 0.56±0.15, p<0.05）

圖 1-3 A CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。miR-210 mimic 組細(xì)胞的增殖能力顯著減弱（P<0.01），而 miR-210 inhibitor 組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)。B&C 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡能力。miR-210 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.001），而 miR-210 抑制組，細(xì)胞凋亡顯著減少（P<0.01）。D-H miR-210 過(guò)表達(dá)組，Bcl-2 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.01）表達(dá)水平均降低，BAX 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.05）表達(dá)水平均升高；而 miR-210 抑制組與之相反。③遷移與侵襲能力的比較采用 Transwell 模型檢測(cè) miR-210 對(duì) HTR-8/SVneo 細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，過(guò)表達(dá) miR-210 后，細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目均較陰性對(duì)照組顯著減少，見(jiàn)圖 1-4A&C。而抑制 miR-210 的表達(dá)后，細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目均較陰性對(duì)照組顯著增多，見(jiàn)圖 1-4A&C。進(jìn)一步地，檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）轉(zhuǎn)錄
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R714.2

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本文編號(hào)：2681837