發(fā)布時間：2020-05-26 12:31

【摘要】：第一部分miR-210對EVT的生物學功能的調(diào)節(jié)的作用目的通過調(diào)節(jié)miR-210在人絨毛外滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo細胞中的表達,觀察其對滋養(yǎng)細胞增殖,遷移,侵襲,凋亡及小管形成能力的影響,探討miR-210對EVT的生物學功能的影響。方法1、采用原位雜交技術(shù)對miR-210在早孕期絨毛組織及母體蛻膜組織的表達進行定位;2、在HTR-8/SVneo細胞中轉(zhuǎn)染miR-210 mimic以增強miR-210的表達,同時轉(zhuǎn)染miR-210 mimic NC作為陰性對照,qRT-PCR檢測兩組細胞的miR-210的表達;3、在HTR-8/SVneo細胞中轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor以減弱miR-210的表達,同時轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor NC作為陰性對照,qRT-PCR檢測兩組細胞的miR-210的表達;4、CCK-8法測定轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞的增殖能力;5、流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞的凋亡能力;6、Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞的遷移和侵襲能力;7、小管形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細胞的小管形成能力;8、qRT-PCR和Western Blot分別從RNA和蛋白水平檢測兩組細胞MMP2、Bcl-2、BAX、VEGF-A、PIGF的表達。結(jié)果1、miR-210在絨毛滋養(yǎng)細胞和蛻膜EVT中均有表達,且蛻膜EVT中miR-210的表達水平低于絨毛滋養(yǎng)細胞。2、與miR-210 mimic NC相比,miR-210 mimic組miR-210的表達水平明顯升高;且細胞的增殖,遷移,侵襲,小管形成能力均減弱,而細胞的凋亡能力增強;同時MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表達水平均下降,BAX在m RNA及蛋白表達水平均升高,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表達均下降;3、與miR-210 inhibitor NC相比,miR-210 inhibitor組miR-210的表達水平明顯下降;且細胞的增殖,遷移,侵襲,小管形成能力均增強,而細胞的凋亡能力減弱;同時MMP2,Bcl-2,在m RNA及蛋白表達水平均升高,BAX在m RNA及蛋白表達水平均下降,VEGF-A及PIGF在m RNA水平表達均升高;結(jié)論調(diào)節(jié)miR-210的表達可改變HTR-8/SVneo細胞的增殖,遷移,侵襲,凋亡及小管形成能力,表明miR-210對EVT的生物學功能具有調(diào)控作用。第二部分miR-210調(diào)控Notch1的表達介導滋養(yǎng)細胞遷移與侵襲功能目的探討miR-210調(diào)控NOTCH1介導的絨毛外滋養(yǎng)細胞生物學功能的作用及其分子機制。方法1、qRT-PCR和Western Blot分別從RNA和蛋白水平檢測子癇前期患者胎盤組織與同期正常孕婦的胎盤組織中的NOTCH1的表達;同時檢測其中miR-210的m RNA表達水平;2、采用IHC法對早孕絨毛組織及蛻膜進行NOTCH1的表達定位;3、實驗分組sh-NOTCH1:轉(zhuǎn)染NOTCH1沉默質(zhì)粒至HTR-8/SVneo細胞,對應的陰性對照組為scramble sh RNA(sh-Scb);miR-210 mimic:轉(zhuǎn)染miR-210 mimic至HTR-8/SVneo細胞,對應的陰性對照組為miR-210 mimic NC;miR-210 inhibitor:轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor至HTR-8/SVneo細胞,對應的陰性對照組為miR-210 inhibitor NC;miR-210 inhibitor NC+sh-NOTCH1:將miR-210敲低陰性對照組與NOTCH1沉默質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細胞;miR-210 inhibitor+sh-NOTCH1:將miR-210敲低組與NOTCH1沉默質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細胞;4、qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞miR-210對NOTCH1的調(diào)節(jié)作用;5、Transwell實驗模型檢測細胞遷移及侵襲能力;結(jié)果1、與正常胎盤組織相比,子癇前期患者胎盤組織中miR-210的表達水平升高,而NOTCH1的表達水平降低;且在子癇前期患者的胎盤組織中,miR-210與NOTCH1在m RNA水平的表達呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系;2、NOTCH1在絨毛及蛻膜組織中滋養(yǎng)細胞中均有表達,且在蛻膜組中的表達增強;3、下調(diào)NOTCH1的表達,HTR-8/SVneo細胞中NOTCH1在m RNA及蛋白水平均表達下降,同時細胞的遷移及侵襲能力減弱;4、上調(diào)miR-210的表達會減弱HTR-8/SVneo細胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同時細胞的遷移及侵襲能力均減弱;5、下調(diào)miR-210的表達會增強HTR-8/SVneo細胞中NOTCH1的m RNA及蛋白水平,同時細胞的遷移及侵襲能力均升高;若同時共轉(zhuǎn)染NOTCH1沉默質(zhì)粒,NOTCH1表達水平與對照組相比,幾乎不受影響,且HTR-8/SVneo細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力恢復至對照組水平;結(jié)論miR-210可減弱NOTCH1的表達,抑制滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲能力,可能是子宮螺旋動脈障礙的重要調(diào)控機制。
【圖文】：

圖 1-2 qRT-PCR 檢測 miR-210 的相對表達水平。過表達組 HTR-8/SVneo 細胞miR-210 的 RNA 水平顯著高于陰性對照組（*：P＜0.05），而抑制組 HTR-8/SVneo細胞 miR-210 的 RNA 水平顯著低于陰性對照組（***：P＜0.001）。三、miR-210 對滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響①細胞增殖能力比較CCK-8 法檢測 miR-210 對 HTR-8/SVneo 細胞增殖能力的影響，結(jié)果見圖1-3。與 miR-210 mimic NC 組相比，miR-210 mimic 組細胞的增殖能力顯著減弱（1.16±0.05 vs 0.88±0.04, p<0.01）。而與 miR-210 inhibitor NC 組相比，miR-210inhibitor 組細胞的增殖能力顯著增強（0.94±0.02 vs 1.07±0.03, p<0.05）。②細胞凋亡能力比較流式細胞術(shù)檢測 miR-210 對 HTR-8/SVneo 細胞凋亡能力的影響，結(jié)果見圖1-3。與 miR-210 mimic NC 組相比，miR-210 mimic 組細胞的凋亡能力增強（5.52±0.16 vs 12.36±0.10, p<0.001），，Bcl-2的mRNA（1.14±0.14 vs 0.56±0.15, p<0.05）

圖 1-3 A CCK-8 法檢測細胞增殖能力。miR-210 mimic 組細胞的增殖能力顯著減弱（P<0.01），而 miR-210 inhibitor 組細胞的增殖能力顯著增強（P<0.05）。流式細胞術(shù)。B&C 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡能力。miR-210 過表達組細胞凋亡顯著增加（P<0.001），而 miR-210 抑制組，細胞凋亡顯著減少（P<0.01）。D-H miR-210 過表達組，Bcl-2 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.01）表達水平均降低，BAX 的 mRNA（P<0.05）及蛋白（P<0.05）表達水平均升高；而 miR-210 抑制組與之相反。③遷移與侵襲能力的比較采用 Transwell 模型檢測 miR-210 對 HTR-8/SVneo 細胞遷移與侵襲能力的影響。倒置光學顯微鏡下計數(shù)，過表達 miR-210 后，細胞遷移與侵襲數(shù)目均較陰性對照組顯著減少，見圖 1-4A&C。而抑制 miR-210 的表達后，細胞遷移與侵襲數(shù)目均較陰性對照組顯著增多，見圖 1-4A&C。進一步地，檢測細胞遷移與侵襲相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）轉(zhuǎn)錄
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.2

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本文編號：2681837