【摘要】：宮頸癌(human cervical cancer cells)的發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中位居第一位,其是一種嚴(yán)重威脅女性生命健康的疾病。目前為止,宮頸癌最為常用的治療手段為手術(shù)治療、放射治療及化療。據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過(guò)80%的宮頸癌患者需要放射治療,而其療效并不理想,臨床上Ⅰ和Ⅱ期的患者經(jīng)過(guò)放射治療后生存率只有65%-85%,而Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌患者經(jīng)過(guò)放射治療后5年的生存率僅為20%-50%。對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行放射治療后可能引起全身性的不良反應(yīng),如骨髓造血功能障礙、消化道不適,放射治療還能夠造成局部損傷,如放射性直腸炎、放射性膀胱炎、卵巢萎縮、盆腔組織纖維化等等,這給患者造成了不同程度的痛苦和多種損傷。臨床上,放射治療和化療常常聯(lián)合使用,如果在放射治療前對(duì)患者進(jìn)行放射治療敏感性檢測(cè),并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)放射劑量的應(yīng)用,可以最大化的減輕患者身體創(chuàng)傷并減少治療費(fèi)用,因此,研究宮頸癌細(xì)胞放射敏感性,尋找提高宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的方法是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。小檗堿(Berberine)又稱為黃連素,是提取于毛茛科植物黃連、黃柏等根莖中的一種天然生物堿,屬于異喹啉類,其具有廣泛的生物學(xué)功能。小檗堿最初主要用于治療胃腸道相關(guān)疾病,具有清熱解毒及抗菌消炎作用,隨著研究的不斷深入,小檗堿還具有消炎、降血脂、降血壓、抗心律失常、降血糖、改善胰島素抵抗、降低雄激素等作用,其在消化道疾病、心血管、內(nèi)分泌、婦科等多種疾病的治療過(guò)程中具有一定的價(jià)值。近年來(lái)的研究表明,小檗堿還具有抗腫瘤作用。在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),小檗堿在安全非毒性的劑量范圍內(nèi)可以抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng),一方面它抑制多種致癌物質(zhì)如亞硝基胍、殺魚(yú)菌素、四氯化碳等對(duì)機(jī)體的損傷,并通過(guò)影響N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase,NAT)的活性抑制癌細(xì)胞的正常生理功能;另一方面它可以阻滯癌細(xì)胞的細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞中脫氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide acid,DNA)及蛋白的合成,使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活,抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,對(duì)不同種類的腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制不同。小檗堿除了能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到直接殺傷作用之外,還可以通過(guò)增加對(duì)其他相關(guān)途徑的調(diào)控作用進(jìn)一步抑制腫瘤生長(zhǎng),例如:小檗堿可以加強(qiáng)紫杉醇對(duì)胃腸道相關(guān)惡性腫瘤的抑制作用,在三氧化二砷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞瘤凋亡中小檗堿具有協(xié)同作用,并且小檗堿聯(lián)合柔紅霉素可以治療白血病,另外,小檗堿還可以增加乳腺癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞的放射治療敏感性,因此,明確小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及放射敏感性的影響和機(jī)制對(duì)于臨床治療宮頸癌具有十分重要的意義。本研究以宮頸癌細(xì)胞為主要研究對(duì)象,用不同濃度的小檗堿處理后,運(yùn)用CCK-8方法檢測(cè)小檗堿對(duì)3株宮頸癌細(xì)胞的增殖活性的影響,篩選出作用較為明顯的一株細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,用Western blot法檢測(cè)小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞STAT3、p-STAT3水平的影響,最后通過(guò)細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞存活曲線,并根據(jù)單擊多靶模型參數(shù)計(jì)算放射增敏比,以明確小檗堿對(duì)宮頸癌放射敏感性的影響,并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討,這對(duì)研究小檗堿的抗腫瘤作用和放射增敏作用具有重要意義。第一部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響研究方法在體外培養(yǎng)3株宮頸癌細(xì)胞Siha、HeLa、Caski,分別用含有小檗堿終濃度為5、10、15、20 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3株細(xì)胞,同時(shí)用不含有小檗堿的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3株細(xì)胞,48h后,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。結(jié)果5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 小檗堿作用后的宮頸癌細(xì)胞 Siha、HeLa、Caski的增殖活性與對(duì)照組細(xì)胞相比均明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小檗堿可以抑制Siha、HeLa、Caski細(xì)胞增殖,其半數(shù)抑制濃度分別為:(16.84±3.52)μmol/L、(23.54±8.67)μmol/L、(21.86±6.35)μmol/L。小檗堿對(duì)Siha細(xì)胞抑制生長(zhǎng)的作用比其他兩株細(xì)胞更強(qiáng)。結(jié)論小檗堿可以抑制宮頸癌細(xì)胞Siha、HeLa、Caski的增殖,其對(duì)Siha細(xì)胞抑制生長(zhǎng)的作用比其他兩株細(xì)胞更強(qiáng)。后續(xù)可選用17 μmol/L的小檗堿作用于Siha細(xì)胞進(jìn)一步研究。第二部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期及凋亡的影響研究方法1.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細(xì)胞48 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。2.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細(xì)胞48 h,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3水平。3.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細(xì)胞48 h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。4.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細(xì)胞48 h,Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinBl、CDK1表達(dá)水平。結(jié)果1.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞凋亡率為(32.25±1.25)%,而經(jīng)過(guò)不含有小檗堿作用后的Siha細(xì)胞凋亡率為(9.32±0.95)%,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小檗堿作用后的宮頸癌Siha細(xì)胞凋亡增多。2.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高,以GAPDH為內(nèi)參,Cleaved Caspase-3表達(dá)量為0.97±0.09,而沒(méi)有經(jīng)過(guò)小檗堿處理后的Siha細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)量為0.23±0.06,二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小檗堿可能通過(guò)提高Cleaved Caspase-3表達(dá),促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。3.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞G2/M期比例為(42.91±4.57)%,而沒(méi)有經(jīng)過(guò)小檗堿處理后的Siha細(xì)胞G2/M期比例為(7.68±1.23)%,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說(shuō)明小檗堿能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G2/M期。4.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞中CyclinBl、CDK1蛋白水平均下降,以GAPDH為內(nèi)參,CyclinB1蛋白表達(dá)量為0.85±0.07,CDK1蛋白表達(dá)量為0.36±0.04,而沒(méi)有經(jīng)過(guò)小檗堿處理的Siha細(xì)胞中Cyclin]B1蛋白表達(dá)量為1.14±0.08,CDK1蛋白表達(dá)量為1.09±0.12,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示小檗堿可能通過(guò)降低CyclinBl、CDK1蛋白水平影響宮頸癌細(xì)胞周期。結(jié)論1.小檗堿通過(guò)提高Cleaved Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌Siha細(xì)胞凋亡。2.小檗堿通過(guò)降低CyclinB1、CDK1蛋白水平,將宮頸癌Siha細(xì)胞阻滯在G2/M 期。第三部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞STAT3、p-STAT3水平影響研究方法用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細(xì)胞48h,Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白STAT3、p-STAT3水平。結(jié)果半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,而p-STAT3水平下降。以GAPDH為內(nèi)參,半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)量為0.15±0.04,未經(jīng)小檗堿處理的Siha細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)量為0.82±0.06,二者相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小檗堿可能通過(guò)降低STAT3磷酸化影響宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。結(jié)論半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,而p-STAT3水平下降。小檗堿可能通過(guò)降低STAT3磷酸化水平影響宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。第四部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性影響研究方法含有半數(shù)抑制濃度的小檗堿培養(yǎng)液培養(yǎng)宮頸癌Siha細(xì)胞,用0、2、4、6、8 Gy X射線照射細(xì)胞,細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放射敏感性。結(jié)果半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低,小檗堿能夠提高宮頸癌的放療敏感性,增敏比為1.550。結(jié)論小檗堿能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,阻滯細(xì)胞周期,增加宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。
【圖文】：

第一部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響表１不同濃度小檗堿對(duì)Ｓｉｈａ細(xì)胞增殖活性的影響（％，ｘ±５＾邐組別邐Ｓｉｈａ逡逑對(duì)照組邐１００．００逡逑５邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐８９．６４±６．７４ａ逡逑ｌＯｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐７０．２４±９．２６ｂ逡逑１５ｎｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐５６．０７±５．３１ｅ逡逑邐２０邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐４２．３１邋土６＿３４ｄ逡逑對(duì)照組相比，３尸＜０．０５；邋＊＾＜０．０５；邋ｅＰ＜０．０５；呤＜０．０５逡逑

第一部分小檗堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響２不同濃度小檗堿對(duì)ＨｅＬａ細(xì)胞增殖活性的影響（％，逡逑邐ＭＪ邐ＨｅＬａ邐逡逑對(duì)照組邐１００．００逡逑５邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐９５．３１±６．２７ａ逡逑１０（＿ｉｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐８６．２４±４．２８ｂ逡逑１５ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐７４．６９±５．８５ｅ逡逑２０邋（ｉｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐６０．８４±５．４５ｄ逡逑對(duì)照組相比，ａＰ＜0．0５；邋＞＜０．０５；邋￡戶＜０．０５；邋ｄＰ＜０．０５逡逑
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2680055