【摘要】：宮頸癌(human cervical cancer cells)的發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中位居第一位,其是一種嚴重威脅女性生命健康的疾病。目前為止,宮頸癌最為常用的治療手段為手術治療、放射治療及化療。據(jù)統(tǒng)計有超過80%的宮頸癌患者需要放射治療,而其療效并不理想,臨床上Ⅰ和Ⅱ期的患者經(jīng)過放射治療后生存率只有65%-85%,而Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌患者經(jīng)過放射治療后5年的生存率僅為20%-50%。對宮頸癌患者進行放射治療后可能引起全身性的不良反應,如骨髓造血功能障礙、消化道不適,放射治療還能夠造成局部損傷,如放射性直腸炎、放射性膀胱炎、卵巢萎縮、盆腔組織纖維化等等,這給患者造成了不同程度的痛苦和多種損傷。臨床上,放射治療和化療常常聯(lián)合使用,如果在放射治療前對患者進行放射治療敏感性檢測,并根據(jù)檢測結果指導放射劑量的應用,可以最大化的減輕患者身體創(chuàng)傷并減少治療費用,因此,研究宮頸癌細胞放射敏感性,尋找提高宮頸癌細胞放射敏感性的方法是目前研究的熱點和重點。小檗堿(Berberine)又稱為黃連素,是提取于毛茛科植物黃連、黃柏等根莖中的一種天然生物堿,屬于異喹啉類,其具有廣泛的生物學功能。小檗堿最初主要用于治療胃腸道相關疾病,具有清熱解毒及抗菌消炎作用,隨著研究的不斷深入,小檗堿還具有消炎、降血脂、降血壓、抗心律失常、降血糖、改善胰島素抵抗、降低雄激素等作用,其在消化道疾病、心血管、內分泌、婦科等多種疾病的治療過程中具有一定的價值。近年來的研究表明,小檗堿還具有抗腫瘤作用。在體外的細胞實驗中發(fā)現(xiàn),小檗堿在安全非毒性的劑量范圍內可以抑制多種癌細胞的生長,一方面它抑制多種致癌物質如亞硝基胍、殺魚菌素、四氯化碳等對機體的損傷,并通過影響N-乙酰轉移酶(N-acetyltransferase,NAT)的活性抑制癌細胞的正常生理功能;另一方面它可以阻滯癌細胞的細胞周期,抑制腫瘤細胞中脫氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide acid,DNA)及蛋白的合成,使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)級聯(lián)反應激活,抑制癌細胞生長、誘導癌細胞凋亡,對不同種類的腫瘤細胞作用機制不同。小檗堿除了能夠對腫瘤細胞起到直接殺傷作用之外,還可以通過增加對其他相關途徑的調控作用進一步抑制腫瘤生長,例如:小檗堿可以加強紫杉醇對胃腸道相關惡性腫瘤的抑制作用,在三氧化二砷誘導的神經(jīng)細胞瘤凋亡中小檗堿具有協(xié)同作用,并且小檗堿聯(lián)合柔紅霉素可以治療白血病,另外,小檗堿還可以增加乳腺癌細胞、鼻咽癌細胞的放射治療敏感性,因此,明確小檗堿對宮頸癌細胞生長、凋亡及放射敏感性的影響和機制對于臨床治療宮頸癌具有十分重要的意義。本研究以宮頸癌細胞為主要研究對象,用不同濃度的小檗堿處理后,運用CCK-8方法檢測小檗堿對3株宮頸癌細胞的增殖活性的影響,篩選出作用較為明顯的一株細胞作為研究對象,通過流式細胞術檢測小檗堿對宮頸癌細胞凋亡及細胞周期的影響,用Western blot法檢測小檗堿對宮頸癌細胞STAT3、p-STAT3水平的影響,最后通過細胞克隆實驗繪制細胞存活曲線,并根據(jù)單擊多靶模型參數(shù)計算放射增敏比,以明確小檗堿對宮頸癌放射敏感性的影響,并對其可能的作用機制進行探討,這對研究小檗堿的抗腫瘤作用和放射增敏作用具有重要意義。第一部分小檗堿對宮頸癌細胞增殖的影響研究方法在體外培養(yǎng)3株宮頸癌細胞Siha、HeLa、Caski,分別用含有小檗堿終濃度為5、10、15、20 μmol/L的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3株細胞,同時用不含有小檗堿的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3株細胞,48h后,用CCK-8法檢測細胞增殖活性,并計算半數(shù)抑制濃度。結果5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 小檗堿作用后的宮頸癌細胞 Siha、HeLa、Caski的增殖活性與對照組細胞相比均明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小檗堿可以抑制Siha、HeLa、Caski細胞增殖,其半數(shù)抑制濃度分別為:(16.84±3.52)μmol/L、(23.54±8.67)μmol/L、(21.86±6.35)μmol/L。小檗堿對Siha細胞抑制生長的作用比其他兩株細胞更強。結論小檗堿可以抑制宮頸癌細胞Siha、HeLa、Caski的增殖,其對Siha細胞抑制生長的作用比其他兩株細胞更強。后續(xù)可選用17 μmol/L的小檗堿作用于Siha細胞進一步研究。第二部分小檗堿對宮頸癌細胞周期及凋亡的影響研究方法1.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細胞48 h,流式細胞術檢測細胞凋亡。2.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細胞48 h,Western blot檢測凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3水平。3.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細胞48 h,流式細胞儀檢測細胞周期。4.用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細胞48 h,Western blot檢測細胞周期相關蛋白CyclinBl、CDK1表達水平。結果1.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞凋亡率為(32.25±1.25)%,而經(jīng)過不含有小檗堿作用后的Siha細胞凋亡率為(9.32±0.95)%,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小檗堿作用后的宮頸癌Siha細胞凋亡增多。2.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞中Cleaved Caspase-3水平升高,以GAPDH為內參,Cleaved Caspase-3表達量為0.97±0.09,而沒有經(jīng)過小檗堿處理后的Siha細胞中Cleaved Caspase-3表達量為0.23±0.06,二者相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小檗堿可能通過提高Cleaved Caspase-3表達,促進宮頸癌細胞凋亡。3.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞G2/M期比例為(42.91±4.57)%,而沒有經(jīng)過小檗堿處理后的Siha細胞G2/M期比例為(7.68±1.23)%,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。說明小檗堿能夠將細胞阻滯在G2/M期。4.半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞中CyclinBl、CDK1蛋白水平均下降,以GAPDH為內參,CyclinB1蛋白表達量為0.85±0.07,CDK1蛋白表達量為0.36±0.04,而沒有經(jīng)過小檗堿處理的Siha細胞中Cyclin]B1蛋白表達量為1.14±0.08,CDK1蛋白表達量為1.09±0.12,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。提示小檗堿可能通過降低CyclinBl、CDK1蛋白水平影響宮頸癌細胞周期。結論1.小檗堿通過提高Cleaved Caspase-3表達誘導宮頸癌Siha細胞凋亡。2.小檗堿通過降低CyclinB1、CDK1蛋白水平,將宮頸癌Siha細胞阻滯在G2/M 期。第三部分小檗堿對宮頸癌細胞STAT3、p-STAT3水平影響研究方法用半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用于宮頸癌Siha細胞48h,Western blot檢測STAT3信號通路相關蛋白STAT3、p-STAT3水平。結果半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞中STAT3蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化,而p-STAT3水平下降。以GAPDH為內參,半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞中p-STAT3蛋白表達量為0.15±0.04,未經(jīng)小檗堿處理的Siha細胞中p-STAT3蛋白表達量為0.82±0.06,二者相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。小檗堿可能通過降低STAT3磷酸化影響宮頸癌細胞的生長和凋亡。結論半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞中STAT3蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化,而p-STAT3水平下降。小檗堿可能通過降低STAT3磷酸化水平影響宮頸癌細胞的生長和凋亡。第四部分小檗堿對宮頸癌細胞放射敏感性影響研究方法含有半數(shù)抑制濃度的小檗堿培養(yǎng)液培養(yǎng)宮頸癌Siha細胞,用0、2、4、6、8 Gy X射線照射細胞,細胞克隆形成實驗檢測放射敏感性。結果半數(shù)抑制濃度的小檗堿作用后的Siha細胞存活分數(shù)降低,小檗堿能夠提高宮頸癌的放療敏感性,增敏比為1.550。結論小檗堿能夠抑制宮頸癌細胞增殖,促進凋亡,阻滯細胞周期,增加宮頸癌細胞的放射敏感性。
【圖文】：

第一部分小檗堿對宮頸癌細胞增殖的影響表１不同濃度小檗堿對Ｓｉｈａ細胞增殖活性的影響（％，ｘ±５＾邐組別邐Ｓｉｈａ逡逑對照組邐１００．００逡逑５邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐８９．６４±６．７４ａ逡逑ｌＯｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐７０．２４±９．２６ｂ逡逑１５ｎｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐５６．０７±５．３１ｅ逡逑邐２０邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐４２．３１邋土６＿３４ｄ逡逑對照組相比，３尸＜０．０５；邋＊＾＜０．０５；邋ｅＰ＜０．０５；呤＜０．０５逡逑

第一部分小檗堿對宮頸癌細胞增殖的影響２不同濃度小檗堿對ＨｅＬａ細胞增殖活性的影響（％，逡逑邐ＭＪ邐ＨｅＬａ邐逡逑對照組邐１００．００逡逑５邋ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐９５．３１±６．２７ａ逡逑１０（＿ｉｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐８６．２４±４．２８ｂ逡逑１５ｐｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐７４．６９±５．８５ｅ逡逑２０邋（ｉｍｏｌ／Ｌ邋給藥組邐６０．８４±５．４５ｄ逡逑對照組相比，ａＰ＜0．0５；邋＞＜０．０５；邋￡戶＜０．０５；邋ｄＰ＜０．０５逡逑
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33

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本文編號：2680055