發(fā)布時(shí)間：2017-03-25 22:03

  本文關(guān)鍵詞：短尾蝮蛇毒解離素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMT)因具有異位種植生長(zhǎng)和組織侵襲的能力,而被認(rèn)為與惡性腫瘤生物學(xué)行為相似。其中子宮內(nèi)膜細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的異位粘附、種植、生長(zhǎng)是關(guān)鍵,因此有效地阻斷該過程已成為治療EMT的重要策略之一。整合素在細(xì)胞粘附、遷移、生長(zhǎng)等過程中起著重要的作用,基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmetallo Proteinase-9,MMP-9)是細(xì)胞完成粘附、遷移和侵襲的生理或病理過程的關(guān)鍵物質(zhì),MMP-9可通過與整合素的相互活化而加強(qiáng)細(xì)胞間的粘附作用,還能促進(jìn)新生血管形成。蛇毒解離素是整合素的拮抗劑,因含精-甘-天冬氨酸(RGD)序列可抑制整合素在細(xì)胞粘附、遷移等過程。故本文應(yīng)用短尾蝮蛇毒解離素阻斷大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位遷移、粘附和侵襲,觀察其對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性EMT的療效,并通過測(cè)定解離素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞及大鼠異位病灶MMP-9的表達(dá)研究其機(jī)制。以期闡釋解離素治療EMT的療效和機(jī)制,為使之成為EMT新療法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.短尾蝮蛇毒(Gloydius brevicaudus Venom,GBV)的分離純化及活性鑒定1)Superdex 75凝膠過濾色譜:應(yīng)用分子篩原理將蛋白質(zhì)按分子量大小分離。2)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析:利用陰離子交換原理將蛋白按不同等電點(diǎn)分離。3)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度。4)Born法鑒定其抗血小板聚集活性。2.解離素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性EMT模型形成的不同階段的治療作用1)手術(shù)法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥模型:將大鼠的子宮內(nèi)膜剝離下來,自體移植入腹壁富含血管處。移植后28天,打開腹腔觀察異位灶的生長(zhǎng)情況。大鼠的給藥分為建模前給藥、建模后給藥、成模后給藥三種給藥方案。2)解離素EMT建模前給藥對(duì)大鼠異位灶形成的影響:移植前將子宮內(nèi)膜浸泡于1.5μg/ml解離素中孵育30min后再施異位移植術(shù),對(duì)照組用相同體積生理鹽水(normal saline,NS)孵育。移植后28天,打開大鼠腹腔觀察異位灶生長(zhǎng)情況。3)解離素EMT建模后給藥對(duì)大鼠異位灶形成的影響:建模手術(shù)結(jié)束后舌下靜脈注射解離素1.5mg/kg,分別于手術(shù)一周后、三周后再給予一次尾靜脈注射相同劑量的解離素,對(duì)照組注射相同劑量NS。移植后28天,打開大鼠腹腔觀察異位灶生長(zhǎng)情況。4)解離素EMT成模后給藥對(duì)大鼠異位灶的影響:建模手術(shù)28天后打開大鼠腹腔觀察異位灶,并判斷是否建模成功。建模成功的大鼠隨機(jī)分成NS對(duì)照組、解離素低劑量組(0.75mg/kg)和高劑量組(1.5mg/kg),分組后再分別于第0周、第2周、第3周尾靜脈給藥一次,三周后打開大鼠腹腔觀察異位灶生長(zhǎng)情況。3.解離素對(duì)大鼠體內(nèi)外EMT的MMP-9表達(dá)影響1)RT-PCR檢測(cè)解離素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞MMP-9m RNA的表達(dá)水平的影響:以1.5μg/ml解離素作用于大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞24 h后,提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)MMP-9m RNA的表達(dá)水平,對(duì)照組用同體積NS孵育。2)Western blot檢測(cè)解離素對(duì)EMT大鼠體內(nèi)異位灶MMP-9的表達(dá)影響:提取解離素三種給藥方案的大鼠子宮內(nèi)膜異位灶的總蛋白,Western blot檢測(cè)各組蛋白MMP-9的表達(dá)量。結(jié)果:1.GBV的分離純化及活性鑒定GBV經(jīng)凝膠過濾和陰離子交換層析等分離純化過程,經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一蛋白條帶,相對(duì)分子量約為7700道爾頓(D)。該目的蛋白具有抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性,IC50為0.594μg/ml,暫定名為GBV-IV-4,與前人分離結(jié)果一致。2.解離素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性EMT模型形成的不同階段的治療作用1)手術(shù)法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥模型:手術(shù)建模后28天觀察發(fā)現(xiàn)移植成功的移植物形成透亮的包塊,或半透明的囊腫,表面血管清晰,部分異位灶囊腫和周圍組結(jié)締組織、脂肪組織粘連,一些囊腫甚至和腸管粘連。形成的子宮內(nèi)膜異位灶體積為(37.10±14.77)cm3。2)解離素EMT建模前給藥對(duì)大鼠異位灶形成的影響:NS對(duì)照組(n=6)和解離素給藥組(1.5μg/ml,n=11)的異位灶體積分別為33.41±28.85 cm3和8.93±11.34 cm3,重量分別為29.01±12.99 mg和11.62±11.42 mg,解離素給藥組較NS組異位灶體積明顯減小,重量明顯減輕(*P0.05)。3)解離素EMT建模后給藥對(duì)大鼠異位灶形成的影響:NS對(duì)照組(n=6)和解離素給藥組(1.5mg/kg,n=7)的異位灶體積分別為58.50±37.71 cm3、5.33±5.48 cm3,重量分別為101.98±75.19 mg、19.34±9.71 mg,解離素給藥組較NS對(duì)照組異位灶體積明顯減小(**P0.01),重量明顯減輕(*P0.05)。4)解離素EMT成模后給藥對(duì)大鼠異位灶的影響(n=6):NS對(duì)照組、解離素低劑量組(0.75mg/kg·d-1)和高劑量組(1.5mg/kg·d-1)的給藥前異位灶體積分別為36.19±19.09 cm3、35.15±15.88 cm3和39.95±9.33 cm3,給藥后體積分別為(31.20±15.57 cm3、24.44±14.29cm3、22.01±10.47 cm3。給藥前各組異位灶體積差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組相比,解離素給藥組異位灶體積均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P0.05)。3.解離素對(duì)大鼠體內(nèi)外EMT的MMP-9表達(dá)影響1)解離素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞MMP-9 m RNA表達(dá)水平的影響:RT-PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞MMP-9m RNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)解離素在1.5μg/ml劑量即可明顯抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的MMP-9m RNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,解離素組中MMP-9m RNA表達(dá)有明顯下降變化(*P0.05)。2)解離素對(duì)大鼠體內(nèi)子宮內(nèi)膜異位灶MMP-9的表達(dá)影響:Western blot檢測(cè)大鼠體內(nèi)子宮內(nèi)膜異位灶MMP-9的表達(dá),結(jié)果顯示SD大鼠子宮內(nèi)膜異位灶在解離素在EMT建模前、建模后以及成模后給藥后,MMP-9的表達(dá)量較對(duì)照組均有所下降(*P0.05)。結(jié)論:GBV解離素能使SD大鼠子宮內(nèi)膜異位灶的體積減小,重量減輕,其對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性EMT具有治療作用;初步的研究表明解離素對(duì)SD大鼠EMT的治療作用可能與其阻斷整合素與其配體如細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixes,ECM)的結(jié)合,減少M(fèi)MP-9的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 子宮內(nèi)膜異位癥 解離素 MMP-9 粘附 侵襲 血管生成
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.71
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一章 短尾蝮蛇毒解離素的分離純化及活性鑒定16-26
• 1. 儀器與材料16-17
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 3. 結(jié)果19-24
• 4. 討論24-26
• 第二章 大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥模型建立及解離素不同給藥方案對(duì)異位灶的影響26-40
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 3. 結(jié)果29-37
• 4. 討論37-39
• 5. 附圖39-40
• 第三章 解離素對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞及病灶MMP9表達(dá)的影響40-49
• 1. 儀器與材料40-41
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 3. 結(jié)果45-48
• 4. 討論48-49
• 全文結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 綜述53-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果61-62
• 致謝62

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本文編號(hào)：267822