【摘要】：研究目的:復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是連續(xù)發(fā)生3次及3次以上的妊娠失敗,大多數(shù)發(fā)生在妊娠早期的流產(chǎn)。RSA的發(fā)病因素很多,如血栓、免疫、遺傳及解剖異常等。目前,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因以及發(fā)病的機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚未明確。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一個含巰基的氨基酸,是蛋氨酸代謝的過程中產(chǎn)生的重要的中間產(chǎn)物。大量的臨床流行病學(xué)及實驗室研究資料表明Hcy升高與心腦血管病、血栓性疾病密切關(guān)聯(lián)。近期也有研究提示血漿Hcy水平的升高是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的又一個危險因素。因此,本文將通過對臨床樣本的檢測,驗證血漿Hcy水平與RSA的關(guān)聯(lián),通過細(xì)胞分子生物學(xué)的實驗方法,研究Hcy對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能作用的影響,并探討RSA血漿Hcy變化的分子機(jī)制。研究對象1.正常早孕組:40例,在蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科計劃生育門診就診婦女,以前沒有發(fā)生過自然流產(chǎn)史,已經(jīng)生育過健康的子代者,平均年齡為(27.5±4.3)歲,就診時經(jīng)血液檢查HCG升高,以及超聲影像學(xué)可以見到妊娠囊和卵黃囊,證實正處于妊娠狀態(tài);抽取人流前外周血,平均停經(jīng)的時間為(54.4±4.1)天。本組的研究對象須排除以下異常:1.以往發(fā)生過自然流產(chǎn)和胎停史的患者;2.妊娠前發(fā)生基礎(chǔ)性疾病史;3.患者有腹痛和陰道流血等先兆流產(chǎn)的征象。2.RSA組:40例,為2017年01月01日至2017年08月31日在蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心門診就診的婦女,以往與同一個配偶發(fā)生過連續(xù)3次以上的胚胎停止發(fā)育流產(chǎn)的患者,平均年齡為(31.2±5.8)歲,就診時經(jīng)血液檢查HCG升高,以及超聲影像學(xué)可見到妊娠囊及卵黃囊,證實此次妊娠狀態(tài),后又經(jīng)超聲診斷為空孕囊,或有胚芽但無胎心,抽取人流前外周血,流產(chǎn)患者的平均停經(jīng)時間為(64.2±6.7)天。本組研究對象須排除妊娠前的以下異常:1.生殖道解剖異常;2.成功妊娠前的基礎(chǔ)性疾病史;3.低纖維蛋白血癥和血小板增多癥;4.自身抗體陽性:抗核抗體、抗磷脂抗體等其他;5.異常甲狀腺激素及抗甲狀腺抗體陽性;6.血栓前的病理狀態(tài);7.陰道分泌物檢測支原體、衣原體以及解脲支原體陽性;8.夫妻雙方的染色體缺失或核型異常。研究方法1.采集正常妊娠及RSA患者外周血,離心獲得血漿,用同型半胱氨酸的試劑盒檢測血漿中Hcy水平。2.用細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體標(biāo)記MPs,用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)分析正常妊娠及RSA婦女血漿中MPs總數(shù)量及EMPs數(shù)量。3.用核酸結(jié)合熒光染料PicoGreen檢測正常妊娠及RSA婦女血漿中游離DNA水平。4.用不同濃度Hcy溶液刺激HUVEC,用CCK8方法檢測Hcy對HUVEC生長的影響;用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色,FCM檢測PI染色陽性細(xì)胞數(shù);用FCM檢測HUVEC釋放的EMPs數(shù)量。5.用流式細(xì)胞術(shù)檢測正常妊娠及RSA婦女血漿中細(xì)胞因子水平。6.采集正常妊娠婦女及RSA婦女的絨毛組織,實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法,檢測MTHFR、CBS、MAT1A及BHMT的mRNA表達(dá)水平。研究結(jié)果1.與正常妊娠婦女比較,RSA婦女的血漿同型半胱氨酸濃度顯著增高。2.與正常妊娠婦女比較,RSA婦女血漿MPs總數(shù)及EMPs數(shù)量,血漿中游離DNA水平顯著升高。血漿MPs總數(shù)與血漿游離DNA水平之間呈正相關(guān)。3.用不同濃度的Hcy(0、1.5、1、2、4、8 mmol/L)處理HUVEC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較,Hcy刺激后,HUVEC細(xì)胞存活率明顯降低,PI染色陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加,HUVEC細(xì)胞釋放的EMPs數(shù)量顯著增加。4.檢測血漿細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)RSA婦女血漿IL-2和TNF-α(Th1分泌)顯著高于正常妊娠婦女,存在Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)失衡,偏向Th1。5.實時定量PCR檢測胎盤絨毛中Hcy代謝相關(guān)蛋白酶,發(fā)現(xiàn)RSA婦女絨毛組織中的MAT1A mRNA表達(dá)水平顯著低于與正常對照。結(jié)論通過上述實驗研究,我們發(fā)現(xiàn)RSA婦女血漿Hcy升高,高Hcy血癥可能是RSA的獨立的危險因素。流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織中MAT1A缺乏,可能導(dǎo)致代謝過程中Hcy產(chǎn)生增加,導(dǎo)致RSA婦女血漿Hcy水平升高,刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外,Th1/Th2調(diào)節(jié)失衡可能也是RSA發(fā)生的原因之一。因此,本研究闡述了Hcy在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的作用及分子機(jī)制,也為RSA的早期診斷和防治提供了新的思路和治療靶點。
【圖文】：

. 正常懷孕及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女血漿 Hc女與正常懷孕 NP 相比，血漿 Hcy 水平顯著差異。女血漿 MPs 總數(shù)增加胞的成分，介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞，參與免疫調(diào)節(jié)及血管新生等過程。收集正常FCM 檢測血漿中 MPs 總數(shù)（見圖 3）。

比正常懷孕 NP 婦女的血漿 MPs 總數(shù)照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。血漿內(nèi)皮細(xì)胞 MPs 數(shù)量增加很多，例如來源于血小板（Pla細(xì)胞（white blood cell，WBC）、
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.21

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本文編號：2677680