【摘要】：目的:子癇前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期常見的病理綜合征,其發(fā)病機制尚不明確。全身小血管痙攣是其主要病理生理改變,本實驗前期研究發(fā)現,子癇前期孕婦胎盤可產生并釋放大量胎盤源性微囊泡(Placenta-dervied microvesicles,pcMVs)進入母體血液循環(huán)中,提示可能與子癇前期的血管痙攣所致母嬰并發(fā)癥有關。本研究采用機械法制造的C57BL/6J小鼠胎盤pcMVs,通過體內實驗經鼠尾注射pcMVs,應用激光散斑觀察其腦血流灌注量、體外血管環(huán)張力實驗觀察pcMVs對血管痙攣的作用以及注射pcMVs后孕鼠胚胎發(fā)育的影響,初步探索子癇前期發(fā)生血管痙攣的機制,為子癇前期發(fā)病機制的研究提供新的思路和依據。方法:(1)C57小鼠以雌雄比3:1進行合籠配對,在標準條件下飼養(yǎng),并進行妊娠天數鑒定;(2)采用機械法制備C57孕鼠胎盤pcMVs,通過電鏡、粒徑測量和流式細胞儀計數鑒定;(3)體外血管環(huán)張力實驗檢測pcMVs對非孕小鼠離體動脈的血管痙攣作用;(4)體內實驗通過激光散斑觀察經鼠尾靜脈注射pcMVs后對C57小鼠腦血流灌注量的影響;(5)在孕鼠妊娠第7天鼠尾靜脈注射pcMVs連續(xù)1周,在孕15天收集孕鼠胎盤和胚胎,測量胎盤與胚胎大小重量,HE染色觀察胎盤病理變化。結果:(1)通過透射電鏡可觀察到體外制備的pcMVs的完整結構,而粒徑檢測也表明pcMVs的直徑是在100-700nm之間,流式細胞儀檢測pcMVs表面AV特異抗體的表達為10.1%并可計算pcMVs的數量;(2)在非孕小鼠離體動脈環(huán)實驗中,與對照組相比,pcMVs能夠引起血管段的收縮反應(2.283±0.248mN VS 0.200±0.063mN,P值0.001);(3)鼠尾靜脈注射pcMVs的17.2s±1.3s后,C57小鼠出現腦血流灌注量下降,注射前血流灌注量為352.342±33.564PU,而注射后血流灌注量為210.532±41.971PU,血流灌注量恢復為272.043±22.764PU;與正常組相比,注射pcMVs后,小鼠血流灌注量下降明顯(40.70%±8.57%VS 1.18%±1.98%,P值0.001),隨后血流又恢復,但無法恢復至正常水平(77.73%±8.89%VS 100%±1.39%,P值0.001);(4)與對照相比,妊娠小鼠注射pcMVs后胚胎數量減少(5.3個±1.2個VS 8.0個±0.9個,P值=0.001),孕鼠胎盤重量明顯減輕(0.082±0.010g VS 0.058±0.013g,P值=0.004),胎鼠重量也明顯減輕(0.267±0.034g VS 0.082±0.011g,P值0.001),小鼠胎盤直徑明顯縮短(0.827±0.046cm VS 0.633±0.064cm,P值0.001),且胎盤母體面邊緣明顯出血,迷路區(qū)域血流明顯減少并有白細胞浸潤。結論:(1)通過體內、體外實驗發(fā)現,pcMVs能夠引起血管痙攣的反應,并可引起非孕小鼠血流灌注量的下降,提示pcMVs所致血管痙攣可能與子癇前期發(fā)病有關;(2)體外制備的pcMVs可導致胎盤母體面結構的破壞,抑制胚胎的生長發(fā)育,研究提示pcMVs可能通過引起子宮胎盤血管痙攣導致子癇前期發(fā)生并影響胚胎發(fā)育。
【圖文】：

圖 1 體外制備的 pcMVs 的電子顯微鏡鑒定和粒徑鑒定；A，pcMVs 的電子顯鏡鑒定（白色箭頭）；B，pcMVs 的粒徑鑒定（粒徑范圍為 100-700nm 之間）。1.2.2pcMVs 的流式細胞儀計數結果：在 FSC/SSC 散點圖中，使用 Megamix 標準微球來圈定直徑＜0.9um 的區(qū)域即圖 2A 所框選中的 P1 區(qū)域均為直徑＜0.9um 的 pcMVs 區(qū)域；使用 Spherote計數微球來框選中計數微球的位置，P2 區(qū)域即為計數微球的位置。在流式上后，圖 2B 為 pcMVs 樣本的陰性對照，而圖 2C 為 Annexin V 抗體的 EDTA 同陰性對照。圖 2C 中框選區(qū)域即則為樣本中 pcMVs 的數量。根據前述公式即換算并稀釋至合適濃度。

9圖 2 體外制備的 pcMVs 的流式計數結果；A，Megamix 標準微球的框選設定，P1 框選的區(qū)域均是直徑＜0.9um 的 pcMVs，P2 框選的區(qū)域均是計數微球；B，pcMVs 樣本的陰性對照；C，Annexin V 的 EDTA 陰性對照；D，框選區(qū)域為 pcMVs。1.2.3 非孕雌鼠鼠尾靜脈注射 pcMVs 后小鼠反應結果：在 pcMVs 濃度梯度實驗（表 1）中：用 0.9×107個/ml 濃度通過鼠尾靜脈注射 100ul 后，該組小鼠均立即出現死亡；而用 0.6×107個/ml 濃度通過鼠尾靜脈注射 100ul 后，小鼠均立即出現抽搐痙攣的反應，但隨后在 30min 內，，小鼠又逐漸恢復至正常狀態(tài)；而用 0.3×107個/ml 濃度通過鼠尾靜脈注射 100ul 后，小鼠基本沒有任何反應。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.244

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