【摘要】：目的本研究把人胎盤來源間充質(zhì)干細胞(hPDMSCs)體外誘導分化為胰島樣細胞(ILC),之后通過尾靜脈植入妊娠期糖尿病(GDM)孕鼠體內(nèi),通過測定血糖及血清中胰島素來判斷誘生細胞的功能,為人胎盤來源干細胞在GDM患者的臨床應用提供基礎理論研究依據(jù)。此外,本實驗還通過檢測人胎盤來源干細胞誘導分化為胰島樣細胞的可能性,來探討人胎盤來源干細胞對妊娠期糖尿病干預作用機制,以期待對GDM、以及產(chǎn)后的Ⅱ型糖尿病的診斷和治療起到一定指導作用。方法在無菌條件下獲取人胎盤組織,從中提取人胎盤源間充質(zhì)干細胞進行分離、培養(yǎng)。然后利用流式細胞技術進行鑒定,觀察分離培養(yǎng)的細胞是否表達CD44和CD105等,以確定分離之細胞是間充質(zhì)干細胞。將鑒定完畢的干細胞通過含有高糖培養(yǎng)基及低糖培養(yǎng)基將其誘導分化為胰島樣細胞,整個誘導周期約需28天左右。將誘導分化后細胞用雙硫腙(DTZ)染色,通過二苯基硫卡巴腙(DTZ)染色確定胰島細胞的特異性。選取雌性SD大鼠40只,雄性SD大鼠20只。分為正常孕鼠組10只、GDM鼠生理鹽水干預組10只、GDM鼠未經(jīng)干預組10只,GDM鼠ILC干預組10只。GDM組的雌鼠用高脂高糖膳食喂養(yǎng)四周后,將大鼠按雌雄比例2:1比例合籠交配。凡鏡下有可見的精子或查到陰栓,即表明已受孕。之后腹腔注射兩次STZ(鏈脲佐菌素),間隔兩天。妊娠第4天測空腹血糖,空腹血糖16.7 mmol/L定為GDM鼠模型成立。判定模型成功,即行ILC注射。每次移植后2天及剖宮產(chǎn)術前(妊娠第18天行剖宮產(chǎn))用血糖儀測量空腹血糖,采用的是Elisa法測胰島素水平變化。用普通顯微鏡觀察胰島細胞的形態(tài)學變化。結(jié)果1.通過流式細胞儀檢測,第3代人胎盤間充質(zhì)干細胞陽性表達CD44、CD105。所得第3代人胎盤間充質(zhì)干細胞能夠用于干細胞干預實驗。2.誘導7天后即可看到原本分散的細胞開始聚集成團,隨著時間的延長,細胞團的數(shù)目和大小均有明顯的增加,誘導至28天對誘導后胰島樣細胞采用雙硫腙染色法進行鑒定,見團狀細胞被染成紅棕色,證明該細胞為ILC。3.大鼠造模后,于妊娠第4天測空腹血糖,有30只孕鼠空腹血糖16.7mmol/L,為GDM鼠模型成立,納入實驗分組,分ABCD四組。GDM大鼠ILC干預組10只(A組),GDM大鼠未經(jīng)干預組10只(B組),GDM大鼠生理鹽水干預組10只(C組),正常孕鼠組10只(D組)。4.GDM各組的血糖在6d、12d、18d均高于正常孕鼠組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。給予ILC干預GDM組(A組)比B、C組下降更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。A組在妊娠期間,隨著ILC植入次數(shù)的增加,空腹血糖進行性下降;A組與B、C組比較在相同時間點血糖水平均降低,組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);B和C組血糖在孕期無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。GDM各組胰島素在6d、12d、18d均低于正常孕鼠組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。未給予ILC干預GDM組(B、C組)比A組下降更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。A組在妊娠期間,隨著ILC植入次數(shù)的增加,胰島素呈逐漸上升狀態(tài);A組與B、C組比較在相同時間點胰島素水平均上升,組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);B、C組在整個孕期無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.GDM各組胰島數(shù)目明顯減少,體積萎縮,形態(tài)不規(guī)則,結(jié)構(gòu)松散,外分泌細胞及腺泡被破壞,細胞邊界不清,大量淋巴細胞浸潤,高倍鏡下可見胰島細胞數(shù)量減少。ILC干預組(A組)的受損胰腺組織細胞得到修復,胰腺組織萎縮情況發(fā)生逆轉(zhuǎn),空泡變小,炎性浸潤減輕。結(jié)論1.該實驗成功從人胎盤組織提取獲得了胎盤間充質(zhì)干細胞,通過顯微鏡在鏡下觀察其生長及融合情況,證實了其具有間充質(zhì)干細胞特性,能在體外分離、培養(yǎng),并表達干細胞表面相關抗體。2.在體外將hPDMSC誘導分化為胰島樣細胞,并利用雙硫腙染色法將其染成紅棕色,證實誘導的細胞為胰島樣細胞。3.通過尾靜脈將胰島樣細胞移植入GDM大鼠體內(nèi),血糖儀測量血糖、Elisa法檢測移植前后血清胰島素水平,染色觀察胰腺組織形態(tài),誘導細胞干預組孕鼠血糖均有所下降,胰島素水平回升明顯,HE染色誘導細胞干預組胰腺組織明顯修復。
【圖文】：

實驗結(jié)果逡逑（一）人胎盤間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)形態(tài)逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接種４８小時后，，更換培養(yǎng)基液體，貼壁細胞呈長梭形，散在分逡逑布，有的表現(xiàn)為胞漿突起，少部分為多邊形。在顯微鏡下觀察第３代人胎盤來源逡逑間充質(zhì)千細胞，細胞形態(tài)表現(xiàn)為均勻的、一致的成纖維細胞樣，大多數(shù)表現(xiàn)為逡逑單層放射形狀、長梭形、平行排列或漩渦狀生長。下圖為干細胞貼壁生長狀態(tài)，逡逑生長良好（圖１－１，１－２）。逡逑邐

實驗結(jié)果逡逑（一）人胎盤間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)形態(tài)逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接種４８小時后，更換培養(yǎng)基液體，貼壁細胞呈長梭形，散在分逡逑布，有的表現(xiàn)為胞漿突起，少部分為多邊形。在顯微鏡下觀察第３代人胎盤來源逡逑間充質(zhì)千細胞，細胞形態(tài)表現(xiàn)為均勻的、一致的成纖維細胞樣，大多數(shù)表現(xiàn)為逡逑單層放射形狀、長梭形、平行排列或漩渦狀生長。下圖為干細胞貼壁生長狀態(tài)，逡逑生長良好（圖１－１，１－２）。逡逑邐
【學位授予單位】：沈陽醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.256

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本文編號：2674121