【摘要】：目的本研究把人胎盤來源間充質(zhì)干細胞(hPDMSCs)體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞(ILC),之后通過尾靜脈植入妊娠期糖尿病(GDM)孕鼠體內(nèi),通過測定血糖及血清中胰島素來判斷誘生細胞的功能,為人胎盤來源干細胞在GDM患者的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論研究依據(jù)。此外,本實驗還通過檢測人胎盤來源干細胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞的可能性,來探討人胎盤來源干細胞對妊娠期糖尿病干預(yù)作用機制,以期待對GDM、以及產(chǎn)后的Ⅱ型糖尿病的診斷和治療起到一定指導(dǎo)作用。方法在無菌條件下獲取人胎盤組織,從中提取人胎盤源間充質(zhì)干細胞進行分離、培養(yǎng)。然后利用流式細胞技術(shù)進行鑒定,觀察分離培養(yǎng)的細胞是否表達CD44和CD105等,以確定分離之細胞是間充質(zhì)干細胞。將鑒定完畢的干細胞通過含有高糖培養(yǎng)基及低糖培養(yǎng)基將其誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞,整個誘導(dǎo)周期約需28天左右。將誘導(dǎo)分化后細胞用雙硫腙(DTZ)染色,通過二苯基硫卡巴腙(DTZ)染色確定胰島細胞的特異性。選取雌性SD大鼠40只,雄性SD大鼠20只。分為正常孕鼠組10只、GDM鼠生理鹽水干預(yù)組10只、GDM鼠未經(jīng)干預(yù)組10只,GDM鼠ILC干預(yù)組10只。GDM組的雌鼠用高脂高糖膳食喂養(yǎng)四周后,將大鼠按雌雄比例2:1比例合籠交配。凡鏡下有可見的精子或查到陰栓,即表明已受孕。之后腹腔注射兩次STZ(鏈脲佐菌素),間隔兩天。妊娠第4天測空腹血糖,空腹血糖16.7 mmol/L定為GDM鼠模型成立。判定模型成功,即行ILC注射。每次移植后2天及剖宮產(chǎn)術(shù)前(妊娠第18天行剖宮產(chǎn))用血糖儀測量空腹血糖,采用的是Elisa法測胰島素水平變化。用普通顯微鏡觀察胰島細胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果1.通過流式細胞儀檢測,第3代人胎盤間充質(zhì)干細胞陽性表達CD44、CD105。所得第3代人胎盤間充質(zhì)干細胞能夠用于干細胞干預(yù)實驗。2.誘導(dǎo)7天后即可看到原本分散的細胞開始聚集成團,隨著時間的延長,細胞團的數(shù)目和大小均有明顯的增加,誘導(dǎo)至28天對誘導(dǎo)后胰島樣細胞采用雙硫腙染色法進行鑒定,見團狀細胞被染成紅棕色,證明該細胞為ILC。3.大鼠造模后,于妊娠第4天測空腹血糖,有30只孕鼠空腹血糖16.7mmol/L,為GDM鼠模型成立,納入實驗分組,分ABCD四組。GDM大鼠ILC干預(yù)組10只(A組),GDM大鼠未經(jīng)干預(yù)組10只(B組),GDM大鼠生理鹽水干預(yù)組10只(C組),正常孕鼠組10只(D組)。4.GDM各組的血糖在6d、12d、18d均高于正常孕鼠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。給予ILC干預(yù)GDM組(A組)比B、C組下降更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。A組在妊娠期間,隨著ILC植入次數(shù)的增加,空腹血糖進行性下降;A組與B、C組比較在相同時間點血糖水平均降低,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);B和C組血糖在孕期無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GDM各組胰島素在6d、12d、18d均低于正常孕鼠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。未給予ILC干預(yù)GDM組(B、C組)比A組下降更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。A組在妊娠期間,隨著ILC植入次數(shù)的增加,胰島素呈逐漸上升狀態(tài);A組與B、C組比較在相同時間點胰島素水平均上升,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);B、C組在整個孕期無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.GDM各組胰島數(shù)目明顯減少,體積萎縮,形態(tài)不規(guī)則,結(jié)構(gòu)松散,外分泌細胞及腺泡被破壞,細胞邊界不清,大量淋巴細胞浸潤,高倍鏡下可見胰島細胞數(shù)量減少。ILC干預(yù)組(A組)的受損胰腺組織細胞得到修復(fù),胰腺組織萎縮情況發(fā)生逆轉(zhuǎn),空泡變小,炎性浸潤減輕。結(jié)論1.該實驗成功從人胎盤組織提取獲得了胎盤間充質(zhì)干細胞,通過顯微鏡在鏡下觀察其生長及融合情況,證實了其具有間充質(zhì)干細胞特性,能在體外分離、培養(yǎng),并表達干細胞表面相關(guān)抗體。2.在體外將hPDMSC誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞,并利用雙硫腙染色法將其染成紅棕色,證實誘導(dǎo)的細胞為胰島樣細胞。3.通過尾靜脈將胰島樣細胞移植入GDM大鼠體內(nèi),血糖儀測量血糖、Elisa法檢測移植前后血清胰島素水平,染色觀察胰腺組織形態(tài),誘導(dǎo)細胞干預(yù)組孕鼠血糖均有所下降,胰島素水平回升明顯,HE染色誘導(dǎo)細胞干預(yù)組胰腺組織明顯修復(fù)。
【圖文】：

實驗結(jié)果逡逑（一）人胎盤間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)形態(tài)逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接種４８小時后，，更換培養(yǎng)基液體，貼壁細胞呈長梭形，散在分逡逑布，有的表現(xiàn)為胞漿突起，少部分為多邊形。在顯微鏡下觀察第３代人胎盤來源逡逑間充質(zhì)千細胞，細胞形態(tài)表現(xiàn)為均勻的、一致的成纖維細胞樣，大多數(shù)表現(xiàn)為逡逑單層放射形狀、長梭形、平行排列或漩渦狀生長。下圖為干細胞貼壁生長狀態(tài)，逡逑生長良好（圖１－１，１－２）。逡逑邐

實驗結(jié)果逡逑（一）人胎盤間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)形態(tài)逡逑ｈＰＤＭＳＣｓ在接種４８小時后，更換培養(yǎng)基液體，貼壁細胞呈長梭形，散在分逡逑布，有的表現(xiàn)為胞漿突起，少部分為多邊形。在顯微鏡下觀察第３代人胎盤來源逡逑間充質(zhì)千細胞，細胞形態(tài)表現(xiàn)為均勻的、一致的成纖維細胞樣，大多數(shù)表現(xiàn)為逡逑單層放射形狀、長梭形、平行排列或漩渦狀生長。下圖為干細胞貼壁生長狀態(tài)，逡逑生長良好（圖１－１，１－２）。逡逑邐
【學(xué)位授予單位】：沈陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.256

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本文編號：2674121