【摘要】：目的:腫瘤的生長(zhǎng)主要是由于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖所致,而細(xì)胞的惡性增殖的主要原因之一是細(xì)胞周期異常調(diào)節(jié)。有報(bào)道指出High mobility group AT-hook 1(HMGA1)在多種癌癥中均參與細(xì)胞的增殖,但其在宮頸癌中的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討HMGA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的影響及其相應(yīng)機(jī)制。方法:Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析HMGA1在宮頸鱗狀上皮和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。收集經(jīng)病理科醫(yī)生診斷為宮頸癌患者的癌組織和癌旁組織,以及因婦科良性疾病切除的正常宮頸組織。Real-time-PCR檢測(cè)目的基因m RNA表達(dá)水平。蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建過(guò)表達(dá)HMGA1的慢病毒和沉默HMGA1的sh RNA慢病毒,感染宮頸癌細(xì)胞系,并進(jìn)行細(xì)胞株的穩(wěn)定篩選。流氏細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同處理因素干預(yù)細(xì)胞后各期細(xì)胞在細(xì)胞周期中所占的比例。采用Cell Counting kit-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)分析宮頸癌細(xì)胞體外增殖活性。Nude mice體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理對(duì)宮頸癌細(xì)胞成瘤能力和瘤體生長(zhǎng)速度的影響。結(jié)果:Oncomine數(shù)據(jù)顯示:在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中,HMGA1的表達(dá)明顯高于宮頸鱗狀上皮組織中的表達(dá)。16位配對(duì)的宮頸癌患者標(biāo)本中檢測(cè)HMGA1 m RNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織的表達(dá)。8位配對(duì)宮頸癌患者標(biāo)本中檢測(cè)HMGA1蛋白表達(dá)水平,結(jié)果與m RNA檢測(cè)的結(jié)果相似。免疫組化檢測(cè)HMGA1蛋白在宮頸癌癌組織和癌旁組織中表達(dá)情況,結(jié)果提示HMGA1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,而且HMGA1的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分級(jí)相關(guān),但與患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)以及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)。相關(guān)機(jī)制探討發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)HMGA1可以加快細(xì)胞周期過(guò)程中G1期向S期轉(zhuǎn)化,促進(jìn)該過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力,從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)。反之,沉默HMGA1表達(dá)則可以減緩細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化,降低相關(guān)蛋白的表達(dá)量,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力,從而減緩腫瘤的生長(zhǎng)速度。結(jié)論:HMGA1在宮頸癌細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中可能起著關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)表明HMGA1的高表達(dá)可能通過(guò)加速細(xì)胞周期進(jìn)展,從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。這也提示我們:將來(lái)HMGA1可能被作為宮頸癌治療的潛在作用靶點(diǎn)。目的:癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和播散是影響癌癥病人預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。而腫瘤細(xì)胞發(fā)生向周?chē)M織的局部浸潤(rùn)侵襲以及經(jīng)過(guò)脈管系統(tǒng)向遠(yuǎn)處器官播散是癌癥轉(zhuǎn)移的必經(jīng)途徑。大量研究報(bào)道,High mobility group AT-hook 1(HMGA1)影響癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討HMGA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用及其相應(yīng)機(jī)制。方法:收集經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科醫(yī)生診斷為宮頸癌的患者的癌組織,以及因婦科其它良性疾病而行全子宮切除術(shù)患者的正常宮頸組織。使用傳統(tǒng)方法提取組織和細(xì)胞中的總RNA,real-time PCR方法檢測(cè)目的基因m RNA表達(dá)。免疫組化探討HMGA1在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的原發(fā)灶組織中的表達(dá)差異。構(gòu)建過(guò)表達(dá)HMGA1的慢病毒和沉默HMGA1的sh RNA慢病毒,感染宮頸癌細(xì)胞系,并進(jìn)行細(xì)胞株的穩(wěn)定篩選。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HMGA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。利用ALGGEN PROMO網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子HMGA1在其下游靶基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn),并構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒;利用miRWalk2.0網(wǎng)站上預(yù)測(cè)miR-221和miR-222在TIMP3的3’UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),并分別構(gòu)建包含野生型結(jié)合位點(diǎn)和突變型結(jié)合位點(diǎn)的3’UTR報(bào)告載體。染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技術(shù)方法探究HMGA1對(duì)下游靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合作用。使用裸鼠爪墊淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型探討HMGA1對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:無(wú)論是HMGA1 m RNA還是蛋白表達(dá),它們?cè)趯m頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的原發(fā)灶組織中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的原發(fā)灶組織中的表達(dá)。在宮頸癌組織中,miR-221和miR-222的表達(dá)均顯著高于正常宮頸,并且它們的表達(dá)水平均與HMGA1m RNA水平呈正相關(guān)。在體外,HMGA1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲。HMGA1可以調(diào)控miR-221/222基因簇的表達(dá),其作用方式是直接結(jié)合在miR-221/222基因簇共同的啟動(dòng)子上,進(jìn)而增強(qiáng)其啟動(dòng)子的活性,促進(jìn)這兩個(gè)miRNAs的轉(zhuǎn)錄。miR-221和miR-222同樣可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而且它們?cè)谝欢ǔ潭壬峡梢阅孓D(zhuǎn)HMGA1體外促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)效應(yīng)。TIMP3是miR-221/222基因簇共同的下游作用靶基因,miR-221/222基因簇可以影響TIMP3、MMP2和MMP9蛋白水平的表達(dá)。HMGA1同時(shí)也可以調(diào)節(jié)TIMP3、MMP2和MMP9蛋白水平的表達(dá)。裸鼠爪墊淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明,HMGA1可以加速宮頸癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)論:HMGA1可能在宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。HMGA1可能是通過(guò)HMGA1-miR-221/222-TIMP3-MMP2/MMP9信號(hào)通路參與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這提示我們HMGA1可以作為預(yù)測(cè)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。
【圖文】：

1.1：來(lái)自 Oncomine 中的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Zhai cervix 和 Scotto cervix）中人宮頸鱗狀癌和人宮頸鱗狀上皮中 HMGA1 mRNA 的表達(dá)。A 圖顯示在 Zhai cervix 數(shù)據(jù)庫(kù) 例宮頸鱗狀上皮和 21 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌中 HMGA1 mRNA 的表達(dá)差異統(tǒng)計(jì)。在 Scotto cervix 數(shù)據(jù)庫(kù)中，24 例宮頸鱗狀上皮和 32 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌中 HMGNA 的表達(dá)差異。其中縱坐標(biāo)是 mRNA 值取 log2 的中位數(shù)；CSE 是 Cervicaluamous epithelium 的縮寫(xiě)，表示宮頸鱗狀上皮；CSCC 是 Cervical Squamous Cercinoma 的縮寫(xiě)，表示宮頸鱗狀細(xì)胞癌。上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中 HMGA1 mRNA 表達(dá)用 T 檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.0

圖 1.2:HMGA1 在宮頸癌原發(fā)灶組織和配對(duì)癌旁正常組織中的表達(dá)。A 圖顯示的是HMGA1 mRNA 在 16 位宮頸癌病人癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，以癌旁正常組織為對(duì)照，以 GAPDH 為內(nèi)參基因，使用 2-ΔΔCT方法計(jì)算 HMGA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量并使用配對(duì)樣本 T 檢驗(yàn)方法對(duì)癌組織和癌旁正常組織中 HMGA1 表達(dá)進(jìn)行差異分析B 圖是 8 位宮頸癌病人的原發(fā)灶組織和癌旁正常組織中的 HMGA1 蛋白表達(dá)，以GPADH 為內(nèi)參基因。C 圖是對(duì) B 圖定量統(tǒng)計(jì)的 bar 圖，以 GPADH 為內(nèi)參蛋白，，用配對(duì)樣本 T 檢驗(yàn)方法對(duì)癌組織和癌旁組織中 HMGA1 蛋白表達(dá)差異進(jìn)行分析。D 圖示的是 HMGA1 蛋白分別在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織、宮頸腺癌組織、以及配對(duì)的癌旁常組織中免疫組織化學(xué)染色的典型圖片，共 92 例宮頸癌組織和其中 58 個(gè)配對(duì)的癌正常組織，圖片上的比例尺表示 50 微米。E 圖顯示的是使用 IPP6.0 對(duì) HMGA1 的表達(dá)量進(jìn)行定量，平均光密度 MD（mean density）＜0.35 表示 HMGA1 低表達(dá)，平均密度 MD（mean density）＞0.35 表示 HMGA1 高表達(dá)，卡方檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)分析 HMGA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。CC 是 Cervical Carcinoma 的縮寫(xiě)，PC 是
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2672727