【摘要】：目的:分析人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型陽性的宮頸癌(cervical cancer,CC)細胞系(SiHa)和人宮頸永生化鱗狀細胞系(Ect1/E6E7)中長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)及信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表達差異,為探索研究lncRNAs的表達改變在高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)感染導(dǎo)致CC發(fā)生發(fā)展中的重要作用及其可能的分子機制奠定基礎(chǔ)。方法:常規(guī)培養(yǎng)SiHa細胞和Ect1/E6E7細胞;提取RNA(Trizol方法)、純化(mRNA-ONLY?Eukaryotic mRNA Isolation Kit,Epicentre)及質(zhì)量檢測(Agilent ND-1000及標準變性凝膠電泳方法);RNA標記(Arraystar RNA Flash Labeling Kit)與芯片雜交(Agilent SureHyb儀和Agilent DNA Microarray Scanner掃描軟件);數(shù)據(jù)采集(Agilent Feature Extraction v11.0.1.1)軟件)及其標準化(Agilent GeneSpring GX v12.1軟件)后行差異表達分析(Agilent GeneSpring GX v12.1軟件)以及功能分析(GO和KEGG通路分析);以RT-PCR方法驗證SiHa細胞系與Ect1/E6E7細胞系、HPV16陽性的宮頸癌組織、HPV16陽性的正常宮頸組織以及HPV16陽性的宮頸癌前病變組織中與本實驗室前期工作結(jié)果中篩選出的差異改變細胞因子相關(guān)的LncRNAs的芯片實驗結(jié)果。結(jié)果:1.SiHa細胞系與Ect1/E6E7細胞系相比差異表達2倍及以上的上調(diào)lncRNAs共2804條,約占總上調(diào)LncRNAs的11.9%,差異表達2倍及以上的下調(diào)lncRNAs共2372條,約占總下調(diào)LncRNAs的12.1%。差異表達2倍及以上的上調(diào)mRNAs共2405條,約占總上調(diào)mRNAs的28.6%,差異表達2倍及以上的下調(diào)mRNAs共2505條,約占總下調(diào)mRNAs的27.4%;2.SiHa細胞系表達上調(diào)的mRNAs中,生物學(xué)過程類中富集多細胞生物過程調(diào)節(jié)的mRNAs所占比例最大;細胞組分類中富集部分胞內(nèi)組成的mRNAs所占比例最大;分子功能類中富集結(jié)合能力的mRNAs所占比例最大;3.SiHa細胞系表達下調(diào)的mRNAs中,生物學(xué)過程類中富集單一有機體調(diào)節(jié)過程的mRNAs所占比例最大;細胞組分類中富集胞內(nèi)構(gòu)成的mRNAs所占比例最大;分子功能類中富集蛋白結(jié)合能力的mRNAs所占比例最大;4.Pathway分析顯示差異表達mRNAs共富集56條Pathway,其中上調(diào)mRNAs富集28條,下調(diào)mRMAs富集28條;5.在細胞系中用RT-PCR方法驗證lncRNA ENST00000566282、LncRNA NR_038974、LncRNA T287840、LncRNA ENST00000571370共4條差異表達的LncRNAs,其中l(wèi)ncRNA ENST00000566282、LncRNA NR_038974、LncRNA ENST00000571370與芯片結(jié)果一致,LncRNA T287840不一致;6.在宮頸組織中用RT-PCR方法驗證的lncRNA ENST00000566282、LncRNA NR_038974、LncRNA ENST00000571370共3條差異表達的LncRNAs,其中LncRNA NR_038974、LncRNA ENST00000571370與芯片結(jié)果一致,lncRNA ENST00000566282不一致。結(jié)論:1.SiHa細胞系與Ect1/E6E7細胞系相比存在大量差異表達的LncRNAs和mRNAs;2.差異表達的LncRNAs可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,有可能可以作為新的宮頸癌早期診斷的標志物;3.RT-PCR方法驗證細胞系與宮頸組織中與細胞因子相關(guān)的ENST00000566282,NR_038974,T287840,ENST00000571370,其中NR_038974,ENST00000571370與芯片結(jié)果完全一致,說明基因芯片結(jié)果的可靠性,為進一步闡明細胞因子在CC發(fā)生發(fā)展免疫微環(huán)境中的作用打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

測結(jié)果表 1 分光光度計檢測結(jié)果260/280比值OD260/230比值濃度（ng/ul）體積（ul）1.99 2.39 784.01 60.001.88 2.43 368.79 20.00源物質(zhì)的吸收峰，比如酚，糖類等；A260RNA、DNA等；A280：測定蛋白質(zhì)的吸收時，就可以認為RNA中蛋白質(zhì)的污染是可 < 1.8時，說明樣品溶液中蛋白的污染比較明2時，，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了，也不值與280nm處吸收值的比值為2.0，則可以認膠電泳技術(shù)檢測抽提的總 RNAEct1/E6E7

（2804/23520）。其中上調(diào) 1000 倍以上的 1 條，上調(diào) 500 倍以上的 4 條，上調(diào)100 倍以上的 35 條，上調(diào) 10 倍以上的 388 條，上調(diào)倍數(shù)最大的 LncRNA 是NR_024089，上調(diào)倍數(shù)是 2494.49714。下調(diào) 2 倍以上的 LncRNAs 共 2372 條，約占總下調(diào) LncRNAs 的 12.1%（2372/19674）。其中下調(diào) 1000 倍以上的 0 條，下調(diào) 500 倍以上的 3 條，下調(diào) 100 倍以上的 4 條，下調(diào) 10 倍以上的 456 條，下調(diào)倍數(shù)最大的 LncRNA 是 T142050，下調(diào)倍數(shù)是 679.5334693。同時檢測 mRNAs，SiHa 與 Ect1/E6E7 之間 mRNAs 差異表達 2 倍以上且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<=0.05）的 mRNAs 認為是差異表達的 mRNAs，上調(diào) 2 倍以上的 mRNAs 共2405 條，約占總上調(diào) mRNAs 的 28.6%（2405/8404），其中上調(diào) 1000 倍以上的8 條，上調(diào) 500 倍以上的 10 條，上調(diào) 100 倍以上的 70 條，上調(diào) 10 倍以上的 410條，上調(diào)倍數(shù)最大的 mRNA 是 NM_032020，上調(diào)倍數(shù)是 5369.972557。下調(diào) 2倍以上的 mRNAs 共 2505 條，約占總下調(diào) mRNAs 的 27.4%（2505/9147），其中下調(diào) 1000 倍以上的 7 條，下調(diào) 500 倍以上的 6 條，下調(diào) 100 倍以上的 59 條，下調(diào) 10 倍以上的 388 條，下調(diào)倍數(shù)最大的 mRNA 是 NM_003357，下調(diào)倍數(shù)是5245.402626。差異表達的 LncRNAs 和 mRNAs 芯片結(jié)果（見圖 2 及表 2）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：2672977