【摘要】：目的和意義:卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。卵巢癌的病因復(fù)雜,基因因素在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用,涉及抑癌基因的失活和癌基因的激活。因缺乏合適的卵巢腫瘤模型,卵巢癌發(fā)生機制的研究受到限制。p53基因突變與功能喪失是卵巢癌中最常見的基因異常之一。C-Myc基因在卵巢癌中有很高的檢出率。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)ASAP1基因在卵巢癌發(fā)生中具有重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠原代卵巢上皮細胞p53基因進行敲除。同時利用慢病毒載體系統(tǒng)將p53~(-/-)、c-Myc、ASAP1單獨或組合轉(zhuǎn)導(dǎo)入原代小鼠卵巢上皮細胞,研究轉(zhuǎn)基因小鼠上皮細胞的生物學(xué)特性改變。對具有成瘤潛力的細胞株進行NSG小鼠皮下注射,觀察在動物體內(nèi)成瘤情況。為進一步研究ASAP1基因在人卵巢癌中的作用,將ASAP1過表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入SKOV3和OVCAR3細胞系,分析其在人卵巢癌細胞系過表達后對細胞功能的影響。本研究建立了一種小鼠卵巢上皮細胞腫瘤細胞株,該細胞株通過修飾原代小鼠卵巢上皮細胞的p53~(-/-)、c-Myc、ASAP1基因獲得,這3個基因在人類卵巢癌中異常表達。該模型能夠模擬卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程,可用于卵巢癌起始和進展的基本生物學(xué)研究,鑒別卵巢腫瘤的標志物,研究轉(zhuǎn)移能力和侵襲性等生物行為變化以及卵巢腫瘤不同治療方法的特定分子通路改變。人卵巢癌細胞系的研究結(jié)果顯示ASAP1發(fā)揮癌基因作用,促進腫瘤轉(zhuǎn)移和化療藥物抵抗,可能成為一個新的治療靶點。材料與方法:利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建p53基因敲除載體,lentiviralCRISPRv2-p53。C-Myc基因過表達載體pLenti-Myc、ASAP1基因過表達載體pLenti-ASAP1以及p53基因敲除載體lentiviralCRISPRv2-p53,利用慢病毒載體系統(tǒng)進行包裝。將p53~(-/-)、c-Myc以及ASAP1基因單獨或組合轉(zhuǎn)導(dǎo)原代小鼠卵巢上皮細胞,分析轉(zhuǎn)基因小鼠上皮細胞的生物學(xué)特性改變:Western blot檢測蛋白表達情況,MTT法檢測轉(zhuǎn)基因細胞生長增殖能力,利用流式細胞計數(shù)儀對細胞周期進行檢測,軟瓊脂試驗鑒定細胞的錨定非依賴生長能力,用單層培養(yǎng)試驗分析轉(zhuǎn)基因細胞的克隆形成能力。根據(jù)細胞功能試驗結(jié)果選擇p53~(-/-)+Myc+ASAP1基因組合轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠卵巢上皮細胞注射入NSG小鼠皮下,觀察成瘤情況,并對腫瘤進行初步分析。建立ASAP1過表達人卵巢癌SKOV3和OVCAR3細胞系,對照組為熒光素酶載體。分析細胞的遷移、侵襲、增殖、克隆形成以及化療藥物抵抗。結(jié)果:(1)p53基因敲除的小鼠卵巢上皮細胞p53蛋白表達顯著下降,ASAP1、c-Myc轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢上皮細胞ASAP1、c-Myc蛋白表達明顯升高,并能在子代細胞穩(wěn)定遺傳。(2)細胞增殖試驗結(jié)果顯示,p53基因敲除細胞增殖快于對照組(P0.05);p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1組細胞增殖高于對照組(P0.05),而且第4天時p53~(-/-)+ASAP1組高于p53組(P0.05);ASAP1、c-Myc組細胞增殖與對照組沒有明顯差異(P0.05);第4天時,ASAP1+Myc組細胞增殖高于對照組、ASAP1以及c-Myc組(P0.05);從第2天起,p53~(-/-)+Myc+ASAP1組細胞增殖顯著快于其他各組(P0.05)。(3)細胞周期檢測表明,p53~(-/-)、p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1、Myc以及ASAP1細胞株G1期細胞比例顯著低于對照組(P0.05);p53~(-/-)+Myc、Myc以及ASAP1細胞株S期細胞比例顯著高于對照組(P0.05);p53~(-/-)+Myc+ASAP1組G1期細胞比例顯著低于其他各組(P0.05),S期細胞比例顯著高于其他各組(P0.05)。(4)軟瓊脂試驗發(fā)現(xiàn),p53組細胞集落數(shù)量多于對照組(P0.05);p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1、ASAP1、c-Myc以及ASAP1+Myc組細胞均不能形成細胞集落;p53~(-/-)+Myc+ASAP1組細胞集落數(shù)量顯著多于其他各組(P0.05)。(5)單層培養(yǎng)克隆形成試驗表明,p53組細胞克隆多于對照組(P0.05);而p53~(-/-)+Myc、p53~(-/-)+ASAP1細胞克隆少于對照組、p53組(P0.05);ASAP1、c-Myc組細胞克隆多于對照組(P0.05);ASAP1+Myc組細胞克隆多于對照組和ASAP1組(P0.05),但與c-Myc組沒有差異(P0.05);p53~(-/-)+Myc+ASAP1組細胞克隆顯著多于其他各組(P0.05)。(6)異體移植瘤試驗顯示,p53~(-/-)+Myc+ASAP1細胞在NSG小鼠皮下能形成腫瘤,腫瘤組織以及腫瘤組織中分離的腫瘤細胞可檢測到p53蛋白表達降低,ASAP1和c-Myc蛋白過表達。(7)人卵巢癌細胞系SKOV3和OVCAR3過表達ASAP1,導(dǎo)致細胞遷移、侵襲能力能力顯著高于對照組(P0.0001),細胞克隆形成能力和增殖明顯強于對照組(P0.05);上皮細胞標志性蛋白E-cadherin表達明顯低于對照組(P0.05)而間質(zhì)細胞標志性蛋白N-cadherin和vimentin表達顯著高于對照組(P0.05);對紫杉醇誘導(dǎo)細胞凋亡的敏感性低于對照組(P0.05)。結(jié)論:(1)小鼠卵巢上皮細胞敲除抑癌基因p53導(dǎo)致細胞周期紊亂,細胞增殖加快,克隆形成能力增強;在p53敲除背景下,c-Myc基因過表達對細胞功能沒有促進作用,而ASAP1基因過表達促進細胞增殖和細胞周期紊亂,但沒有改變細胞的接觸抑制效應(yīng)。(2)小鼠卵巢上皮細胞過表達c-Myc或ASAP1基因引起DNA合成前期細胞減少、合成期細胞增加,單層培養(yǎng)克隆形成能力增強,但對細胞增殖和細胞轉(zhuǎn)化沒有影響;而c-Myc基因和ASAP1基因同時過表達對細胞功能沒有累積促進作用。(3)敲除抑癌基因p53,同時過表達c-Myc和ASAP1基因,導(dǎo)致原代小鼠卵巢上皮細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化,具有了腫瘤細胞的特征:細胞周期紊亂,細胞增殖迅速,接觸抑制效應(yīng)喪失,能在懸浮狀態(tài)下成簇生長。p53~(-/-)+Myc+ASAP1基因修飾小鼠卵巢上皮細胞能夠在NSG小鼠皮下形成腫瘤。(4)ASAP1基因在卵巢腫瘤發(fā)生中發(fā)揮“驅(qū)動基因”作用,其過表達促進人卵巢癌細胞增殖、存活、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型,抑制化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡。
【圖文】：

效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucle更簡單高效，使用范圍更廣，極大縮短了動物模型制究基因因素在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，，我們利用 C的 p53 基因進行敲除，用慢病毒系統(tǒng)將 p53-/-、ASAP1原代小鼠卵巢上皮細胞，研究轉(zhuǎn)基因小鼠上皮細胞的細胞的生長增殖能力、細胞周期各時相分布、單層培養(yǎng)集落形成能力進行測定。篩選出具有成瘤潛力的細胞株在動物體內(nèi)成瘤情況。1.1 LentiCRISPRv2-p53表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定菌株RISPRv2 載體購自 ZhangLab，該載體具有 Ampicilin核標記，并含有慢病毒包裝元件。結(jié)構(gòu)如下：

圖 2 LentiviralCRISPRv2質(zhì)粒 BsmBI 酶切Fig. 2 LentiviralCRISPRv2 plasmid digested by B注：M，marker；1，酶切質(zhì)粒；2，未酶切質(zhì)Note: M，marker；1，digested plasmid；2，undiges質(zhì)粒 lentiviralCRISPRv2-p53 PCR鑒定結(jié)果1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見 200bp 左右擴增產(chǎn)物 3。圖 3 重組質(zhì)粒 lentiviralCRISPRv2-p53 PCFig. 3 reconstructured plsamid lentiviralCRISPRv2-注：M，marker；1、3，無模板對照；2、4，p53te: M，marker；1、3，template free contronl；2、4，p5
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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本文編號：2667660