【摘要】：研究背景:受精是獲能后的精子與卵子相互作用并融合形成受精卵的過(guò)程。此過(guò)程始于物種特異性的精卵結(jié)合,進(jìn)而鈣震蕩誘導(dǎo)卵子激活完成第二次減數(shù)分裂后排出第二極體,終于雌、雄原核形成并融合成二倍體受精卵。受精的標(biāo)志是第二極體的排出以及雌、雄原核的形成與融合。正常受精的完成是胚胎發(fā)育及人類(lèi)繁殖的重要前提。在輔助生殖(Assisted reproductive technology,ART)治療中,成熟卵子經(jīng)體外受精(in-vitro fertilization,IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后實(shí)現(xiàn)精卵融合,經(jīng)體外培養(yǎng)完成受精及早期胚胎發(fā)育。然而,ART助孕過(guò)程中存在極少數(shù)病例,表現(xiàn)為反復(fù)多周期受精障礙,無(wú)原核形成。即使應(yīng)用卵子激活技術(shù)(Assisted oocyte-activation,AOA)依舊不能受精,無(wú)法形成胚胎用于移植。目前,人類(lèi)受精障礙的遺傳學(xué)機(jī)制尚不明確。WEEE2(WEE1同源體2,也稱(chēng)為WEE1B)屬于母源基因,編碼WEE2蛋白,是一種新發(fā)現(xiàn)的高度保守的WEE家族成員。2011年,Jeong Su Ohetal報(bào)道通過(guò)注射嗎啡啉(Morpholino oligonucleotide,MO)降調(diào)小鼠卵母細(xì)胞Wee2基因表達(dá)后,經(jīng)孤雌激活或IVF處理后均未見(jiàn)雌、雄原核形成,表現(xiàn)為受精障礙,與臨床上多周期受精障礙的患者表型類(lèi)似。因此,本課題將對(duì)受精障礙病例WEE2基因的全部外顯子進(jìn)行測(cè)序,探討人類(lèi)受精障礙是否與WEE2基因變異相關(guān)。研究目的:探討WEE2基因變異是否導(dǎo)致人類(lèi)卵母細(xì)胞受精障礙。研究方法:體外助孕治療中,將反復(fù)多周期(IVF和或ICSI助孕次數(shù)≥2)受精障礙的漢族女性納入研究對(duì)象。納入患者應(yīng)同時(shí)滿足:(1)年齡≤40歲;(2)染色體核型正常(46,XX);(3)輔助生殖治療中,獲卵數(shù)≥4個(gè)/周期;(4)首次ART助孕表現(xiàn)為卵子不受精,第二周期經(jīng)科研卵子驗(yàn)證丈夫精子有授精能力后,體外受精后依舊表現(xiàn)受精障礙的女性。共納入90例符合上述條件的女性。對(duì)照組選擇有正常孩子生育史,因輸卵管因素來(lái)我院行ART助孕后原核正常形成且正常受精的女性。對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)同時(shí)滿足:(1)有生育史且無(wú)不良孕產(chǎn)史;(2)ART助孕周期中未見(jiàn)異常受精情況;(3)后期隨訪確定再次生育正常胎兒,按照上述標(biāo)準(zhǔn)共納入200例對(duì)照樣本。提取納入所有樣本的外周血DNA,對(duì)WEE2基因的12個(gè)外顯子進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增后行Sanger測(cè)序。整理分析測(cè)序結(jié)果,歸納受精障礙病例WEE2基因的外顯子區(qū)是否存在堿基的異常改變(突變、插入、缺失、重復(fù))。對(duì)于存在堿基異常改變的受精障礙女性,追溯其家系樣本,明確變異的來(lái)源及遺傳方式。結(jié)果:通過(guò)對(duì)90例反復(fù)多周期受精障礙女性行WWE2基因的全部外顯子測(cè)序后,發(fā)現(xiàn)7位患者(接近8%)存在純合/復(fù)合雜合變異。病例1、病例2、病例6攜帶純合變異[病例 1:c.293_294insCTGAGACACCAGCCCAACC(p.Pro98Profs×2);病例2:c.1576 TG(p.Tyr526 Asp);病例6:c.1008_1009insTA(p.His337Tyrfs×24)],病例3、病例4、病例5、病例7攜帶復(fù)合雜合變異[病例3:c.991CA(p.His331Asn)和c.1304_1307delCCAA(p.Thr435Metfs×31);病例4:c.341_342 del AA(p.Lys114Asnfs×20)和 c.864GC(p.Gln288His);病例5:c.lAG(p.0?)和c.1261GA(p.Gly421Arg);病例7:c.585GC(p.Lys195Asn)和c.625GT(p.Glu209X)]。除了變異c.1576TG(來(lái)自病例2)和c.864GC(來(lái)自病例4),其余變異位點(diǎn)經(jīng)人群數(shù)據(jù)庫(kù)查閱后均為新發(fā)變異且疾病數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)均有致病性。對(duì)200例對(duì)照樣本行WEE2基因全部外顯子測(cè)序后,均未發(fā)現(xiàn)上述變異。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)制定的變異分類(lèi)(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合家系系譜圖,結(jié)果顯示W(wǎng)EE2基因新發(fā)現(xiàn)的純合/復(fù)合雜合致病性變異可能與受精障礙相關(guān),且該疾病的遺傳模式為常染色體隱性遺傳。結(jié)論:通過(guò)上述研究,我們推斷WEE2基因存在的純合/復(fù)合雜合變異與受精障礙相關(guān),而引起該表型具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R711.6

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1 趙帥;WEE2基因變異引起受精障礙導(dǎo)致女性不孕[D];山東大學(xué);2019年

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本文編號(hào)：2664284