【摘要】：目的:子癇前期的發(fā)病機(jī)制通常與胎盤氧化應(yīng)激以及凋亡發(fā)生有關(guān)。本研究旨在明確胎盤組織以及滋養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬標(biāo)記蛋白FAM134B(Family with sequence similarity 134,member B)的表達(dá),并闡明其介導(dǎo)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中鈣離子通道功能障礙導(dǎo)致線粒體相關(guān)凋亡在子癇前期(Preeclampsia,PE)發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:收集2017年9月—2017年12月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科分娩的8例PE與8例正常剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤組織。應(yīng)用蛋白印跡法方法驗(yàn)證FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬通過MAMs中的鈣離子通道IP3R導(dǎo)致凋亡蛋白Cytochrome C在PE胎盤和正常胎盤中的表達(dá)差異;同時(shí)通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤中FAM134B,IP3R的陽性表達(dá);使用早孕人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株(Human transformed primary extra villous trophoblast cell line,HTR8/SVneo),通過SNP(Sodium nitroprusside)構(gòu)建PE細(xì)胞模型。使用免疫熒光法和激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞FAM134B于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中和IP3R在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá);構(gòu)建FAM134B慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用蛋白印跡法檢測(cè)在HTR8/SVneo細(xì)胞中沉默和過表達(dá)FAM134B后對(duì)線粒體相關(guān)凋亡的影響;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常組,FAM134B敲低組,FAM134B過表達(dá)組三組細(xì)胞的凋亡百分率。結(jié)果:蛋白印跡法結(jié)果顯示,PE胎盤組織相比于正常胎盤,其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬蛋白FAM134B,鈣離子通道蛋白IP3R和線粒體凋亡蛋白Cytochrome C表達(dá)顯著增加(p0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示PE組胎盤處內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和鈣離子通道蛋白陽性表達(dá)顯著增加(p0.001);蛋白印跡法結(jié)果顯示在SNP誘導(dǎo)的PE細(xì)胞模型中FAM134B,IP3R和Cytochrome C蛋白表達(dá)顯著高于正常HTR8/SVneo細(xì)胞(p0.01);蛋白印跡法和流式細(xì)胞術(shù)顯示在HTR8/SVneo細(xì)胞中沉默和過表達(dá)FAM134B后增加滋養(yǎng)細(xì)胞線粒體的凋亡(p0.05)。結(jié)論:FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬通過線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加,引起滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常,從而參與PE的發(fā)生發(fā)展。本研究為臨床PE的治療提供了理論基礎(chǔ)及潛在的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

白和線粒體相關(guān)凋亡的表達(dá)首先，我們從臨床收集的胎盤制作了石蠟切片，我們使用免疫組化法檢測(cè)了子癇前期胎盤和正常胎盤中 FAM134B 和 IP3R 的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)子癇前期胎盤中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平的提高。結(jié)果表明，與正常組相比，在子癇前期胎盤 FAM134B和 IP3R 陽性表達(dá)增加（圖 1A）（p<0.001）。此外，我們使用蛋白印跡法顯示FAM134B,IP3R,Cytochrome C 的準(zhǔn)確表達(dá)水平（圖 1B，1C）（p<0.05）。由于FAM134B 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的生物標(biāo)志物，胎盤組織中我們發(fā)現(xiàn) FAM134B 水平升高，這意味著更多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的發(fā)生。同時(shí)，我們檢測(cè)到伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的增加，MAMs 鈣離子通道蛋白 IP3R 及線粒體凋亡蛋白 Cytochrome C 等蛋白水平也可檢測(cè)到表達(dá)增加。同時(shí)，免疫組化結(jié)果與蛋白印跡趨勢(shì)相同。這些結(jié)果表明，在子癇前期中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可能借由 MAMs 的鈣離子通道在線粒體中發(fā)揮作用。

圖 2 在滋養(yǎng)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬對(duì) MAMs 鈣離子通道以及凋亡表達(dá)的影響Figure.2 The effect of calcium ion channel protein, and Mitochondrial associated apoptosis onER-phagy in HTR8/SVneo cells（A）蛋白印跡法表明滋養(yǎng)細(xì)胞在 SNP 處理下，IP3R 和 Cytochrome C 通過 FAM134B 影響而顯示的蛋白表達(dá)。（B）免疫熒光圖像分析顯示滋養(yǎng)細(xì)跑在 SNP 處理組下 FAM134B 的相對(duì)表達(dá)水平。（C）激光共聚焦圖像分析顯示滋養(yǎng)細(xì)跑在 SNP 處理組下 FAM134B 的相對(duì)表達(dá)水平。細(xì)胞核顯示為DAPI標(biāo)記的藍(lán)色熒光。目標(biāo)蛋白FAM134B被標(biāo)記為綠色熒光。ER-Tracker被標(biāo)記為紅色熒光放大圖片是ｘ400 和度量尺是 200nM（*p＜0.05，，** p＜0.01）2.3 FAM134B 慢病毒轉(zhuǎn)染使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè) FAM134B 慢病毒轉(zhuǎn)染效率，蛋白印跡法驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染后 FAM134B 蛋白表達(dá)（圖 3）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，慢病毒轉(zhuǎn)染后能夠在蛋白水平明顯抑制 FAM134B 和過表達(dá) FAM134B 的表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染成功。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.244

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本文編號(hào)：2658065