發(fā)布時間：2020-05-08 10:30

【摘要】：一、研究背景和目的三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3,ATO)是中藥砒霜的主要成分,它作為藥物已使用了數(shù)千年。大量的體內(nèi)和體外實驗證明,ATO除了能治療血液系統(tǒng)腫瘤(如APL~([1,2]),多發(fā)性骨髓瘤~([3,4])等),對多種惡性實體瘤如肝癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌等也有強(qiáng)大的抗癌作用~([5-10])。目前認(rèn)為,ATO抗腫瘤作用的機(jī)制較為復(fù)雜,涉及到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制血管生成等多個方面。盡管有關(guān)ATO抗腫瘤的機(jī)制研究有了相當(dāng)大的進(jìn)展,但尚未完全闡明,特別是ATO究竟是通過何種靶分子發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)是核受體超家族成員之一。GR幾乎在所有組織細(xì)胞中表達(dá),其介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)涉及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等多個方面,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。卵巢癌是一種雌激素依賴性的腫瘤,雌激素通過雌激素受體(estrogen receptor,ER)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。但一個令人感興趣的現(xiàn)象是,在卵巢癌組織標(biāo)本中,GR具有高豐度的表達(dá),甚至在沒有雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞中仍有GR的表達(dá),這提示GR可能參與了卵巢癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),ATO能夠誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡,并且可明顯抑制GR的表達(dá),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對ER的抑制率。本課題擬在前期已有發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,探討ATO抑制GR表達(dá)的機(jī)制,進(jìn)一步闡明GR的下調(diào)在ATO影響卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲中的作用及其機(jī)制。二、研究方法我們選用人卵巢癌SKOV3及HO-8910細(xì)胞及其他實體瘤-人肝癌HepG2,人肺腺癌A549細(xì)胞作為研究對象,采用Real-time PCR及Western blot方法檢測ATO對GR mRNA及蛋白表達(dá)的影響。采用細(xì)胞計數(shù)及MTT方法檢測細(xì)胞增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平及細(xì)胞周期的比例。Transwell小室和ibidi劃痕小室分別檢測細(xì)胞垂直和水平遷移的能力。預(yù)包被Matrigel膠的Transwell小室(侵襲小室)檢測檢測細(xì)胞的侵襲能力。三、研究結(jié)果(一)ATO抑制多種腫瘤細(xì)胞中GR mRNA及蛋白的表達(dá)1.ATO可以明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞中GR的表達(dá),且這種抑制效應(yīng)具有劑量依賴性和時間依賴性。2.ATO抑制腫瘤細(xì)胞中GR表達(dá)無細(xì)胞特異性,在人卵巢癌HO-8910細(xì)胞,人肝癌HepG2細(xì)胞,人肺腺癌A549細(xì)胞中均證實ATO抑制GR mRNA及蛋白的表達(dá)。(二)ATO抑制人卵巢癌細(xì)胞GR mRNA及蛋白的表達(dá)的機(jī)制1.ATO可通過DNA的甲基化及促進(jìn)GR mRNA的降解抑制卵巢癌中GR mRNA的表達(dá)。2.ATO能夠增強(qiáng)GR蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體途徑的降解。3.ATO抑制GR蛋白與P38的激活及活性氧的產(chǎn)生有關(guān),與JNK的激活無關(guān)。(三)GR表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)了ATO對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用1.ATO可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,過表達(dá)GR可逆轉(zhuǎn)此種抑制效應(yīng),其機(jī)制可能與GR促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(cyclin D1,cyclin E1,cdc27)的表達(dá)有關(guān)。2.ATO能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲過程,過表達(dá)GR能夠逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。四、結(jié)論本實驗證實ATO能夠以時間依賴性和劑量依賴性方式下調(diào)GR的表達(dá),且這種抑制作用沒有明顯的細(xì)胞特異性。ATO抑制GRmRNA的表達(dá)與DNA甲基化與促進(jìn)GRmRNA的降解有關(guān),而對GR蛋白表達(dá)的抑制作用可能是通過增強(qiáng)其經(jīng)泛素蛋白酶體途徑的降解。P38及活性氧途徑參與了ATO對GR蛋白的下調(diào)。ATO通過抑制GR的表達(dá)抑制多種周期正性蛋白(cyclin D1,cyclin E1,cdc27)進(jìn)而抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖并將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期;ATO通過抑制GR的表達(dá)還可以顯著的抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲過程。
【圖文】：

實驗結(jié)果一、ATO 對卵巢癌細(xì)胞中 GR 表達(dá)的影響（一）ATO 抑制卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞中 GR 表達(dá)為明確 ATO 對卵巢癌細(xì)胞 SKOV3 中 GR 表達(dá)的影響，我們首先用不同濃度 處理細(xì)胞 24h，采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法檢測 GR mRNA 和蛋情況。結(jié)果如圖 1A、B 所示，不同濃度的 ATO 可明顯抑制 GR mRNA 和蛋，2μMATO 即可下調(diào) GR mRNA 和蛋白的表達(dá)，10μMATO 處理細(xì)胞 24h 后 mRNA 和蛋白表達(dá)抑制率分別為 55%（圖 1A，P<0.01）、60%（圖 1B，P<0.0表明，ATO 抑制 GR mRNA 和蛋白的表達(dá)具有劑量依賴性特點。進(jìn)一步，我了10μMATO處理細(xì)胞不同時間后GR mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖示，ATO 處理細(xì)胞后 4h，GR mRNA 即開始下調(diào)，至 48h 降至對照組的 42% P<0.05）。GR 蛋白的表達(dá)處理后 12 開始下調(diào)，，至 48h 降至對照組的 80% P<0.05）。結(jié)果表明，ATO 抑制 GR mRNA 和蛋白的表達(dá)具有時間依賴性

海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（二）ATO 抑制不同來源腫瘤細(xì)胞中 GR 的表達(dá)為探討 ATO 對 GR 的抑制是否具有細(xì)胞特異性，我們用不同濃度的 ATO 處理不同來源的腫瘤細(xì)胞 24h，采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法檢測 GR mRNA 和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖 2 所示，ATO 可明顯抑制人卵巢癌細(xì)胞 HO-8910、人肝癌細(xì)胞 HepG2、人肺腺癌細(xì)胞 A549 細(xì)胞中 GR mRNA 及蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明 ATO對 GR mRNA 及蛋白的抑制作用無明顯細(xì)胞特異性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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本文編號：2654538