【摘要】：目的:構建大鼠部分子宮全層損傷模型,并移植膠原支架/高CYR61水平的人子宮內膜血管旁細胞(endometrial perivascular cells,En-PSCs),觀察其對子宮損傷部位結構和功能的影響。方法:首先通過流式細胞術從子宮內膜單細胞懸液中分選出人En-PSCs。然后分別用CYR61特異性小干擾核糖核酸(si-CYR61)、過表達質粒轉染產生低表達的人EnPSCs(si-CYR61 En-PSCs)及高表達CYR61的人En-PSCs(ov-CYR61 En-PSCs)。將轉染后產生的不同CYR61水平的En-PSCs與人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培養(yǎng)進行成環(huán)和遷移實驗。Sprague-Dawley(SD)大鼠子宮中段系膜對側切除長1.5cm、寬0.5cm的子宮壁建立部分子宮全層損傷的大鼠模型。將正常SD雌性大鼠隨機分為5組:sham組(僅開腹,子宮無損傷)及4個修復組。修復組分為Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組,Collagen/si-CYR61 EnPSCs組和Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組。分別將不同CYR61水平的En-PSCs/膠原支架復合物縫合在相應組的受損子宮組織部位。術后30d和90d,分別收集每組大鼠子宮組織,制作石蠟切片,進行蘇木精和伊紅染色及免疫組織化學方法染色,以觀察子宮受損部位內膜、平滑肌及血管的恢復狀況。術后90d,在2w內,將各組剩余大鼠在發(fā)情期與成年可育的SD雄性大鼠交配,觀察子宮及受損部位妊娠功能的恢復狀況。結果:分選的En-PSCs表達已知的間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)標志物(CD13,CD44,CD73,CD90和CD105),不表達造血系標志物(CD34,CD45,CD56,CD144和HLA-DR)。且En-PSCs具有向脂肪細胞、骨細胞和神經元樣細胞分化的潛能,表明En-PSCs是一種MSCs。成環(huán)和遷移實驗表明,ov-CYR61 En-PSCs能夠促使HUVECs成環(huán)并促進其遷移。動物實驗結果表明,術后30d:Collagen/ovCYR61 En-PSCs組的子宮內膜厚度顯著高于Collagen/En-PSCs組,Collagen/En-PSCs組顯著高于Collagen/PBS組;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組子宮再生部位的α-SMA陽性面積百分比顯著高于Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組與Collagen/PBS組相比則無統(tǒng)計學差異;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組子宮再生部位的血管密度顯著高于Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組顯著高于Collagen/PBS組,Collagen/ovCYR61 En-PSCs組與Collagen/En-PSCs組相比無統(tǒng)計學差異。術后90d:Collagen/ovCYR61 En-PSCs組的子宮內膜厚度顯著高于Collagen/En-PSCs組及Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組與Collagen/PBS組無統(tǒng)計學差異;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組子宮再生部位的α-SMA陽性面積百分比顯著高于Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組顯著高于Collagen/PBS組,Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組與Collagen/En-PSCs組無統(tǒng)計學差異;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組子宮再生部位的血管密度顯著高于Collagen/En-PSCs組及Collagen/PBS組,Collagen/En-PSCs組與Collagen/PBS組無統(tǒng)計學差異。妊娠實驗結果表明,各組大鼠子宮的妊娠率分別是:sham組,100%;Collagen/PBS組,40%;Collagen/En-PSCs,80%;Collagen/si-CYR61 En-PSCs組,12.5%;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組,80%;各組大鼠子宮再生區(qū)域的妊娠率分別是:Collagen/PBS組,0;Collagen/En-PSCs組,20%;Collagen/si-CYR61 En-PSCs組,12.5%;Collagen/ov-CYR61 En-PSCs組,40%。結論:本研究證明CYR61能夠促進血管生成。ov-CYR61 En-PSCs能夠更好地促進大鼠子宮損傷區(qū)域內膜、平滑肌和血管的再生。ov-CYR61 En-PSCs及En-PSCs的移植能夠提高大鼠損傷子宮的妊娠率。ov-CYR61 En-PSCs較En-PSCs移植能夠增加大鼠子宮受損部位的妊娠率。
【圖文】：

圖 1 En-PSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定圖 A 示流式細胞術分選 En-PSCs；圖 B-L 示流式細胞術分析 En-PSCs 的 MSCs 免疫標記物。2 En-PSCs 具有多向分化能力PDGFRβ，NG2 和 α-SMA 是血管旁細胞的特異標志物分子[14]。培養(yǎng)的第 6 代 En-PSCs 表達 PDGFRβ（圖 2A）、NG2（圖 2B）和 α-SMA（圖 2C），，說明 En-PSCs 是血管旁細胞。通過成脂和成骨誘導分化實驗，第 6 代的 En-PSCs 在第 30d 分別經油紅 O染色檢測到脂肪滴（圖 2D）、茜素紅 S 染色檢測到鈣化結節(jié)（圖 2E）。En-PSCs 經成神經分化實驗后，通過免疫熒光染色檢測到神經標志物 NSE（圖 2F）和 NFM（圖2G）。這些結果表明，En-PSCs 具有成脂、成骨和成神經分化潛能。

圖 2 En-PSCs 的鑒定及多向分化潛能圖 A-C 細胞免疫熒光示 En-PSCs 中 PDGFRβ、NG2 和 α-SMA 的表達，標尺：25μm；圖O 染色示脂肪滴，標尺：50 μm；圖 E 茜素紅 S 染色示鈣化結節(jié)，標尺：50 μm；圖 F-光染色示 NSE 和 NFM 的表達，標尺：50 μm。3 En-PSCs 分泌 CYR61 等血管生成相關的多種因子質譜分析顯示，En-PSCs 可分泌與血管生成相關的多種因子（表 1）。在上清中，質譜分析共檢測出 929 種蛋白質。通過 david 6.8（https://david.ncif進行的 Go 功能注釋聚類分析表明，這些識別的蛋白質中含有 203 種分泌蛋出）。通過 Uniprot 在線蛋白庫（https://www.uniprot.org/）與已知與血管生成相關的 781 種蛋白進行比較，其中包含 38 種與血管生成相關的蛋白（表 1）即在其中。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714

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本文編號：2652072