【摘要】：競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)是指具有miRNA結(jié)合位點(diǎn),能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA,抑制miRNA對(duì)靶基因調(diào)控的一類RNA。ceRNA并不是新的RNA分子,而是最新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控功能的一類RNA。其中包含mRNA、lncRNA、假基因、circRNA和sRNA等。18-三體綜合征(18-trisomy syndrome)又稱為愛(ài)德華綜合征(Edwards syndrome),是常見(jiàn)的染色體三體征,是由于人類18號(hào)染色體增多1條造成的染色體畸變,該類患兒臨床表現(xiàn)差異大,可從重度先天畸形到近似正常,重度的臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、面部畸形、生長(zhǎng)遲緩、骨骼異常、心臟和腎臟畸形等。由于18-三體綜合征患兒在胎兒期即存在較高的自然流產(chǎn)率,故新生兒18-三體綜合征的患病率為1/8 000-1/6 000,僅次于唐氏綜合征(Downsyndrome,DS)的發(fā)病率,存在嚴(yán)重的智力低下和多種缺陷,生活往往不能自理,社會(huì)適應(yīng)和勞動(dòng)能力較差,給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。創(chuàng)立新型的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查,尋找18-三體綜合征產(chǎn)前診斷的標(biāo)志物十分重要。本研究主要從circRNA的差異性表達(dá)與mi RNA結(jié)合位點(diǎn)分析、circRNA與miRNA、mRNA三者的網(wǎng)絡(luò)分析、lncRNA在已知類型的基因分布情況以及l(fā)ncRNA差異表達(dá)分析和lncRNA與mi RNA、mRNA相互關(guān)聯(lián)分析、sRNA與已知miRNA分析和新miRNA預(yù)測(cè)等方面進(jìn)行研究分析。目的:通過(guò)獲得的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)譜篩選母血(ES-2)和臍帶血(ES-1)中差異性表達(dá)的lncRNA、circRNA和mi RNA,并對(duì)差異性表達(dá)的circRNA、lncRNA、sRNA與mRNA、mi RNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,探討ceRNA在18-三體綜合征中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控及其作用機(jī)制。方法:選取產(chǎn)前診斷指征為18-三體綜合癥的2名孕婦的外周血以及臍帶血,對(duì)照組為正常的相同孕周期的孕婦臍帶血和外周血,利用Trizol法提取總RNA,使用NanoDrop ND-1000檢測(cè)RNA是否降解并測(cè)定RNA濃度;采用DEGseq分析18-三體綜合癥孕婦的外周血以及臍帶血中的circRNA、LncRNA和s RNA差異表達(dá)譜。根據(jù)circRNA、LncRNA和s RNA以及miRNA與mRNA可能存在的相互作用,分析18-三體綜合征孕婦的臍帶血以及外周血中表達(dá)共同顯著差異的circRNA、LncRNA和sRNA與mRNA可能存在的關(guān)聯(lián)關(guān)系。結(jié)果:(1)妊娠18-三體綜合征孕婦的臍帶血circRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的circRNA 10050個(gè),其中下調(diào)表達(dá)circRNA 5164個(gè),上調(diào)表達(dá)circRNA 4886個(gè)。(2)妊娠18-三體綜合征孕婦的外周血circRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的circRNA13278個(gè),其中下調(diào)表達(dá)circRNA 5007個(gè),上調(diào)表達(dá)circRNA 8271個(gè)。(3)妊娠18-三體綜合征孕婦的臍帶血和外周血circRNA表達(dá)譜進(jìn)行共同分析發(fā)現(xiàn)2876個(gè)共同差異,但只有1510個(gè)上調(diào)下調(diào)方向一致,其中共同下調(diào)表達(dá)circRNA1064個(gè),共同上調(diào)表達(dá)circRNA 466個(gè),其中hg38_circ_0012295的差異倍數(shù)最大。(4)妊娠18-三體綜合征孕婦的臍帶血lncRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的lncRNA 1824個(gè),其中下調(diào)表達(dá)lncRNA 858個(gè),上調(diào)表達(dá)lncRNA 966個(gè)。(5)妊娠18-三體綜合征孕婦的外周血lncRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的lncRNA 1063個(gè),其中下調(diào)表達(dá)lncRNA 628個(gè),上調(diào)表達(dá)lncRNA 535個(gè)。(6)妊娠18-三體綜合征孕婦臍帶血與外周血中共同表達(dá)差異的lncRNA為586個(gè)。臍帶血中與18號(hào)染色體相關(guān)的lncRNA-mRNA分析有65個(gè)lncRNA對(duì)應(yīng)相關(guān)有114個(gè)基因,其中RP11-231E4.5與CNDP2基因的lncRNA-mRNA關(guān)聯(lián)最多。我們挑選了共同差異倍數(shù)大的lncRNA對(duì)應(yīng)的5個(gè)關(guān)鍵基因,分別是CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5,這5個(gè)關(guān)鍵基因不僅在臍帶血中顯著差異表達(dá),而且在孕婦外周血也有同樣的表現(xiàn)。(7)通過(guò)對(duì)sRNA與miRNA表達(dá)譜的關(guān)聯(lián)關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-mi R-182-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-4433a-3p、hsa-mi R-4433b-5p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941共10個(gè)差異表達(dá)miRNA,特別是hsa-miR-20a-5p調(diào)控其對(duì)應(yīng)靶基因mRNA的表達(dá)差異倍數(shù)最大。(8)挑選出18-三體綜合征臍帶血和孕婦的外周血中ceRNA差異表達(dá)與mRNA之間的共同的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)23個(gè)miRNA(hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-624-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-27a-3p),這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)是ceRNA與miRNA、miRNA與mRNA的相互作用的中心樞紐,以不同的方式調(diào)控,相互作用,相互影響。(9)對(duì)circRNA差異基因進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)參與生物過(guò)程的基因有9131個(gè),參與細(xì)胞組成的基因有1201個(gè),參與分子功能的基因有2321個(gè);對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway通路分析,挑選富集的前20位通路分析,發(fā)現(xiàn)臍帶血和外周血的胞吞作用通路最富集。結(jié)論:(1)差異表達(dá)circRNA、lncRNA、sRNA有其對(duì)應(yīng)的miRNA結(jié)合位點(diǎn),有且還可能不止一個(gè),結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)也可能是其他ceRNA的共同位點(diǎn),通過(guò)與mi RNA的相互作用,共同調(diào)控靶基因的表達(dá)。ceRNA在未來(lái)有可能成為18-三體綜合征新的分子生物學(xué)標(biāo)志物。(2)差異表達(dá)基因可能通過(guò)多種途徑、角色參與18-三體綜合征的發(fā)生。(3)CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5這5個(gè)失調(diào)lncRNA有可能對(duì)18-三體綜合征的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。(4)挑選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的23個(gè)miRNA通過(guò)ceRNA與miRNA、miRNA與mRNA的相互作用,以不同的方式調(diào)控,相互作用,相互影響,其中,hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-941最有可能成為診斷18-三體綜合征的生物標(biāo)志物。
【圖文】：

圖 2 sRNA 樣品制備流程圖Fig.2 sRNA sample preparation flow chart樣品檢測(cè)：每個(gè)樣品總量為 3μg 總 RNA 用作輸入t 產(chǎn)生測(cè)序文庫(kù)多重小 RNA 文庫(kù)制備套件適用于碼被添加到屬性序列到每個(gè)樣品。：簡(jiǎn)而言之，NEB 3'SR 適配器直接和特異性連 3'末端。3'結(jié)扎后反應(yīng)，SR RT 引物雜交到過(guò)量持自由）并轉(zhuǎn)化單鏈 DNA 接頭轉(zhuǎn)化成雙鏈 DNA二聚體形成，此外，dsDNA 不是連接的底物由 T的連接步驟中不連接到 5'SR 銜接子上。：將 5'末端銜接子連接至 miRNA 的 5'末端，sNA 合成：第一鏈 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶（RNase H）的 使用 PCR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 LongAmp Taq 2X Mas

查樣本符合標(biāo)準(zhǔn)后，接著在 Small RNA Sampll RNA 的 3'及 5'端特殊構(gòu)造（5'端有完整的 作為原始樣本，所以把接頭直接加到 Small。緊接著經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增儀，，PAGE 膠電泳分離就是 cDNA 文庫(kù)。構(gòu)建原理圖如下圖 3：之后，要求初步把文庫(kù)的濃度稀釋到 1ng/ul接著在 Agilent 2100 上實(shí)施測(cè)定文庫(kù)的插入片效濃度大于 2nM 為止，這個(gè)步驟可以達(dá)到文稱 Q-PCR。的標(biāo)準(zhǔn)后，將庫(kù)檢合格的插入片段按對(duì)應(yīng)的有要求的 pooling 后，最后在 HiSeq/MiSeq 進(jìn)行
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R714.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李培飛;陳聲燦;邵永富;蔣孝明;肖丙秀;郭俊明;;環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能及其在疾病發(fā)生中的作用[J];生物物理學(xué)報(bào);2014年01期

本文編號(hào)：2651716