【摘要】：研究背景和目的:滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常是引起子癇前期的重要因素,目前滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。滋養(yǎng)細(xì)胞因持續(xù)缺氧所導(dǎo)致的過(guò)度凋亡可影響胎盤(pán)形成過(guò)程,進(jìn)而誘發(fā)包括子癇前期(Preeclampsia,PE)在內(nèi)的多種妊娠相關(guān)疾病。野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶(Wild-type p53-induced phosphatase,Wip1)可通過(guò)p38和p53途徑正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存,但其在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)方式及調(diào)控作用目前尚無(wú)報(bào)道。本課題將探討Wip1通過(guò)p53依賴途徑調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡具體機(jī)制,以期為子癇前期發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向。方法:WB和RT-qPCR分別檢測(cè)正常與PE胎盤(pán)組織中Wip1蛋白和mRNA水平;免疫組化和免疫熒光分別檢測(cè)胎盤(pán)組織和HTR8/SVneo細(xì)胞中Wip1的表達(dá)定位;運(yùn)用物理和化學(xué)方法構(gòu)建兩種滋養(yǎng)細(xì)胞體外缺氧模型,并使用Wip1特異性抑制劑GSK2830371和慢病毒包被短發(fā)夾RNA(shRNA)分別抑制Wip1酶活性和表達(dá)后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平變化,同時(shí)WB檢測(cè)cleaved-caspase 9等凋亡相關(guān)分子以進(jìn)一步驗(yàn)證。單獨(dú)或聯(lián)合運(yùn)用p38、Mdm2和蛋白酶體特異性抑制劑處理細(xì)胞模型以檢測(cè)反饋通路中各信號(hào)分子的相互作用;通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)Wip1對(duì)Mdm2-p53互作的調(diào)控作用;最后,WB驗(yàn)證胎盤(pán)組織中各信號(hào)分子的表達(dá)情況。結(jié)果:Wip1在PE胎盤(pán)和PE細(xì)胞模型中均顯著上調(diào),藥物抑制Wip1活性和慢病毒敲降Wip1后均可部分逆轉(zhuǎn)缺氧所誘導(dǎo)的p38磷酸化、cleaved-caspase 9和細(xì)胞凋亡水平,同時(shí)促進(jìn)p53在Ser15位點(diǎn)的磷酸化,并抑制Mdm2-p53結(jié)合。Mdm2降解受到抑制后可導(dǎo)致p53失穩(wěn)態(tài),并抑制p38-Wip1反饋途徑;Mdm2-p53互作減少可使p53累積并激活p38-Wip1反饋途徑。參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞p38-Wip1反饋通路的調(diào)節(jié)因素中,Mdm2-p53的互作過(guò)程比Mdm2的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著更為重要的作用。結(jié)論:缺氧應(yīng)激狀態(tài)下,滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)p38-Wip1反饋途徑來(lái)維持p53穩(wěn)態(tài),當(dāng)該反饋途徑發(fā)生紊亂時(shí)可引起滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡,進(jìn)而誘發(fā)PE發(fā)生。
【圖文】：

24圖 1 Wip1 在 PE 胎盤(pán)和缺氧細(xì)胞模型中表達(dá)異常Fig. 1. Expression pattern of Wip1 is altered in PE placentas and trophoblastic PE modelsA. 對(duì)正常孕婦的絨毛（a-c）、晚期胎盤(pán)（d-f）和蛻膜組織（g-h）進(jìn)行 CK7、CD31、HLA-G和 Wip1 染色來(lái)檢測(cè) Wip1 在內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛柱中的表達(dá)定位情況。比例尺=200μm；B. 正常胎盤(pán)和 PE 胎盤(pán)中 Wip1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，，n=7，*p＜0.05，采用 student’s-t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；C. 正常胎盤(pán)和 PE 胎盤(pán)組織中 Wip1蛋白相對(duì)表達(dá)水平，n=7，***p＜0.001，采用 student’s-t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；D. 對(duì) 24 小時(shí)缺氧、常氧處理后的 HTR8/SVneo 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，比較不同處理下 Wip1（綠色熒光）相對(duì)表達(dá)水平，DAPI（藍(lán)色熒光）用于染細(xì)胞核。比例尺=100μm；E-F. 免疫印跡檢測(cè) 24 小時(shí)缺氧處理后 AMPKα、ACC 磷酸化水平及 Wip1 表達(dá)水平的變化。n=4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，采用 student’s-t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

ncluded as control. Nuclei were counterstained by DAPI (blue). Scale bar, 100μ m; Ehosphorylation levels of AMPKα and ACC, and Wip1 protein expression in HTR8/SVneo cfter 24 h of HII (E) and SIB (F) treatments were examined by Western blotting. n=4, *P<0*P<0.01, ***P<0.001, Student’s t-test. Experiments were performed in triplicate..4 抑制 Wip1 可降低 HTR8/SVneo 細(xì)胞因缺氧所致的凋亡水平為探究Wip1在滋養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)控作用是否與腫瘤細(xì)胞一致——負(fù)性調(diào)控凋亡，本課題組首先通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建 Wip1 敲降細(xì)胞株，并結(jié)合使用 W異性抑制劑 GSK2830371，然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的變化。結(jié)示慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 90%以上，敲降效率為 51.16%（圖 2A-B）；HII 和 S種缺氧條件均可明顯上調(diào) HTR8/SVneo 細(xì)胞凋亡水平，而慢病毒轉(zhuǎn)染SK2830371 處理后可明顯降低細(xì)胞因缺氧引起的凋亡水平（圖 3A-C）。這些結(jié)明，Wip1 在滋養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)控凋亡的方式與腫瘤細(xì)胞并不相同，呈現(xiàn)為正向調(diào)現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.244

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1 顧s

本文編號(hào)：2650411