【摘要】：研究背景 多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性最常見的婦科內分泌代謝疾病,發(fā)病率約15%～20%,臨床上常表現(xiàn)為月經紊亂、卵巢多囊樣改變、不孕,同時伴有肥胖、胰島素抵抗(Insulin resistence,IR)等代謝紊亂,是心血管疾病、子宮內膜癌的高危因素。PCOS是常見的排卵障礙性疾病之一,大樣本的數據調查顯示,近50%的PCOS患者存在原發(fā)性不孕,25%的PCOS患者存在繼發(fā)性不孕。因此,不孕是育齡期PCOS患者的主要臨床問題。在臨床一線治療中,PCOS患者通過促排卵治療6個周期的累計妊娠率可達50%,但仍有部分患者治療無效或妊娠后有較高的流產率,目前認為可能與PCOS伴發(fā)肥胖等代謝異常有關。隨著人類生活和飲食習慣的改變,肥胖的發(fā)病率逐年上升,已有研究表明肥胖是導致慢性疾病如高血壓、糖尿病、冠心病等的主要原因,且肥胖患者的不孕發(fā)生率明顯升高。PCOS患者肥胖的患病率可達30%～60%,以腹型肥胖為主,目前尚未明確它是否與PCOS的發(fā)病有關聯(lián),但肥胖可進一步加重PCOS患者的胰島素抵抗和高雄激素血癥。PCOS患者的卵子和胚胎質量一直是臨床醫(yī)師關注的焦點問題,有學者認為PCOS不孕患者的卵子存在發(fā)育機制障礙,成熟卵率、正常受精率和優(yōu)質胚胎率均降低,影響IVF-ET的成功率;而肥胖又可增加卵子的非整倍體率、內質網應激,改變胞漿內線粒體分布,影響卵子的發(fā)育和胚胎質量,進一步增加PCOS患者不良妊娠結局的發(fā)生。但部分學者認為:隨著體重指數的增加,卵巢對促性腺激素的反應性受損,獲卵數下降,但卵子和胚胎質量無明顯下降,不影響IVF結局。PCOS不孕患者的IVF助孕結局以及肥胖對其結局的影響如何,目前尚無定論。因此,本課題第一部分通過統(tǒng)計分析不同體重指數的PCOS和非PCOS不孕患者IVF-ET的臨床資料,探討PCOS與肥胖對體外受精-胚胎移植臨床結局的影響。胚胎質量和子宮內膜容受性是胚胎成功著床的兩個關鍵因素。在輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)中,隨著胚胎培養(yǎng)和冷凍技術的不斷發(fā)展,優(yōu)質胚胎的獲取率顯著提高,但臨床妊娠率依然較低,考慮與子宮內膜容受性受損密切相關。已有研究表明,在供卵ART助孕時,隨著受卵者體重的增加,其胚胎著床率、臨床妊娠率及活產率明顯下降,考慮肥胖可降低子宮內膜容受性,但具體機制尚不清楚。重度肥胖患者常伴發(fā)胰島素抵抗,而高胰島素血癥可抑制子宮內膜容受性分子如胰島素樣生長因子(IGF-1)受體的表達,影響子宮內膜蛻膜化。眾所周知,PCOS是一種內分泌代謝疾病,常伴發(fā)肥胖、胰島素抵抗等代謝異常。因此,PCOS不孕患者子宮內膜容受性下降可能是其異常的內分泌及代謝環(huán)境共同作用的結果,但有關其發(fā)生機制目前尚無定論。HIF-1是一種關鍵的平衡氧穩(wěn)態(tài)和調節(jié)缺氧反應的轉錄因子,由α和β亞基組成。HIF-1α是HIF-1唯一的氧調節(jié)單位,決定著它的活性。正常氧濃度下,細胞也能合成HIF-1α,但被pVHL(von Hippel-Lindau)介導的泛素化蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解;而缺氧狀態(tài)下,HIF-1α的活性上調并可激活靶基因如血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達,促進血管新生,增加血管通透性;激活葡萄糖轉運蛋白(glucose transporters,GLUTs)1和4的表達,改善細胞的能量代謝,提高細胞的生存能力。近年來,有關HIF-1在生殖領域的研究備受關注,研究證實卵泡內的微環(huán)境是低氧狀態(tài),可刺激顆粒細胞HIF-1α的表達,促進排卵發(fā)生。而胚胎著床期胚胎細胞的快速增殖及分裂,需要在母體及胚胎間建立豐富的血管網以維持其繼續(xù)發(fā)育,此時子宮內膜組織應處于相對缺氧的狀態(tài)。我們推測HIF-1α在胚胎著床期可能具有重要作用,參與調控子宮內膜血管形成、子宮內膜細胞能量代謝等關鍵事件。但目前尚未見HIF-1α對PCOS不孕患者子宮內膜容受性調控的研究報道�；谝酝难芯勘尘�,課題第二部分通過檢測著床期子宮內膜HIF-1α及其靶基因VEGF、GLUTS的表達情況,研究HIF-1α對PCOS不孕患者子宮內膜容受性的調控作用,同時探討肥胖對子宮內膜容受性的影響作用。第一部分:肥胖型PCOS患者IVF-ET妊娠結局的分析研究目的 通過統(tǒng)計分析不同體重指數的PCOS和非PCOS不孕患者IVF/ICSI-ET的臨床資料,探討PCOS及肥胖對體外受精-胚胎移植術妊娠結局的影響。研究方法 回顧性分析2015年1月至2017年12月于煙臺毓璜頂醫(yī)院行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者臨床資料。共納入PCOS不孕患者275例(A組),非PCOS不孕患者(輸卵管因素)781例為對照組(B組)。PCOS的診斷符合2003鹿特丹診斷標準;同時根據亞太地區(qū)人群肥胖標準再次對PCOS不孕患者分為正常體重(A1)和肥胖(A2)組;將非PCOS不孕患者分為正常體重(B1)和肥胖(B2)組。統(tǒng)計分析患者的基本臨床資料如年齡、不孕年限,體重、身高、月經第2～3天空腹測定的基礎生殖內分泌、血脂等項目。所有患者均采用拮抗劑方案,同時記錄注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日雌二醇(E2)、孕酮(P)水平及子宮內膜厚度。注射HCG后34-36h行陰道超聲引導下的穿刺取卵術,記錄獲卵數。所有IVF卵子行短時授精,3h后脫顆粒并于顯微鏡下觀察極體排除情況,記錄MII卵子數和受精數。根據D3胚胎細胞數目、大小等進行形態(tài)學評分,記錄受精數、優(yōu)質胚胎數,并計算出MII卵子率、受精率、優(yōu)質胚胎率等。取卵當日常規(guī)行黃體支持治療,并于術后第3天行胚胎移植術,移植術后14天查血HCG確定是否妊娠,移植后34天陰道超聲檢查確定是否臨床妊娠,后定期隨訪繼續(xù)妊娠情況,并比較各組間的胚胎著床率、臨床妊娠率和早期流產率。研究結果(1)PCOS組中原發(fā)性不孕比例為64.4%,其平均BMI高于對照組(25.84±3.78 vs.24.1±3.59,P0.05);基礎生殖內分泌中AMH、LH、E2、TT以及血脂代謝中CHOL、LDL-C、TG均顯著高于對照組,而HDL-C明顯低于對照組,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。超促排卵過程中,PCOS組的Gn時間、HCG日E2水平、獲卵數明顯高于對照組,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),Gn用量低于對照組,但無顯著差異(P0.05);兩組HCG日子宮內膜厚度、MII卵子率、受精率以及D3優(yōu)胚率均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。與對照組相比,PCOS不孕患者的胚胎著床率和臨床妊娠率均明顯下降,而早期流產率明顯升高,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)PCOS不孕患者中,A2組的平均BMI明顯高于A1組(27.97±2.40vs.21.66±2.10,P0.05),且不孕年限明顯延長(4.41±2.10vs.3.61±1.68),血脂代謝中的CHOL、LDL-C、TG、Lp(α)明顯升高,HDL-C明顯下降,有統(tǒng)計學意義(P0.05);而兩組間的基礎生殖內分泌FSH、LH、E2、TT、AMH等無顯著性差異(P0.05)。IVF-ET治療中,與A1組相比,A2組Gn用量明顯增加,HCG日E2和P水平明顯下降,均有統(tǒng)計學差異(P0.05);HCG日子宮內膜厚度、獲卵數、MII卵子率、受精率及D3優(yōu)胚率均無明顯差異(P0.05);但胚胎著床率和臨床妊娠率明顯下降(P0.05),早期流產率有上升趨勢,尚未達到統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)非PCOS不孕患者中,B2組平均BMI明顯高于B1組(28.00±2.21 vs.21.87±1.94,P0.05),血脂代謝中的LDL-C、TG明顯升高,HDL-C明顯下降,有統(tǒng)計學意義(P0.05);兩組間的基礎生殖內分泌如FSH、LH、AMH等無顯著性差異(P0.05)。IVF-ET治療中,與B1組相比,B2組的Gn時間、用量明顯增加,HCG日E2水平明顯下降,均有統(tǒng)計學差異(P0.05);HCG日子宮內膜厚度、獲卵數、MII卵子率、受精率及D3優(yōu)胚率均無明顯差異。胚胎著床率和臨床妊娠率有下降趨勢,但無明顯差異(P0.05);早期流產率明顯升高,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。研究結論1、PCOS不孕患者中原發(fā)性不孕、肥胖的比率升高,且存在明顯異常的生殖內分泌和脂質代謝紊亂。2、與非PCOS不孕患者相比,PCOS不孕患者的MII卵率和D3優(yōu)胚率無明顯差異,但胚胎著床率和臨床妊娠率明顯下降,且早期流產率明顯升高。3、PCOS和非PCOS合并肥胖的不孕患者,均有明顯異常的脂質代謝。肥胖降低了卵巢反應性和HCG日E2水平,增加了 Gn用量;但不影響獲卵數、MII卵子率和D3優(yōu)胚率。4、肥胖明顯降低PCOS患者的臨床妊娠率,而僅增加非PCOS患者的早期流產率。第二部分:HIF-1α對PCOS患者子宮內膜容受性調控作用的研究研究目的 通過研究著床期子宮內膜HIF-1αmRNA和蛋白表達的情況,探討它對子宮內膜容受性調控的作用;通過比較HIF-1α在不同體重指數的PCOS和非PCOS不孕患者子宮內膜中的表達差異,探討PCOS及肥胖型患者子宮內膜容受性低下的可能機制。研究方法 按照納入/排除標準共入選行IVF-ET治療的PCOS患者40例,輸卵管因素患者(非PCOS)41例,根據亞太地區(qū)人群肥胖標準再次將PCOS患者分為正常體重18例(C1)和肥胖22例(C2)組;將對照患者分為正常體重20例(D1)和肥胖21例(D2)組。記錄患者的基本臨床資料如年齡、不孕時間、基礎內分泌水平,促排卵過程中的生殖激素、子宮內膜厚度、獲卵數等指標,所用促排卵方案、取卵、授精以及卵子成熟度的評估、胚胎的評分均同第一部分所述。所納入患者均因預防OHSS發(fā)生或其他因素取消新鮮周期移植。于取卵后第5天刮匙刮取子宮內膜組織,用熒光PCR、免疫組化等方法檢測HIF-1α、VEGF、GLUT1和GLUT4 mRNA和蛋白表達情況。研究結果1.臨床基本資料結果(1)兩組患者的平均年齡匹配,無顯著性差異(P0.05)。PCOS患者基礎LH、TT、FINS、FBG和HOMA-IR水平顯著高于對照組,有統(tǒng)計學意義(P0.05);而兩組間HCG日E2、P水平、子宮內膜厚度、獲卵數、D3優(yōu)胚率均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)PCOS患者中,C2組的平均BMI、FINS、HOMA-IR顯著高于C1組(P0.05);而兩組間的基礎生殖內分泌如FSH、LH、TT及HCG日子宮內膜厚度、獲卵數、D3優(yōu)質胚胎率等均無顯著性差異(P0.05)。(3)非PCOS患者中,D2與D1組相比,除了平均BMI明顯升高,其余指標如基礎生殖內分泌和超促排卵中的子宮內膜厚度、獲卵數、D3優(yōu)質胚胎率等均無顯著性差異(P0.05)。2.熒光PCR結果(1)PCOS組和對照組中,著床期子宮內膜HIF-1α mRNA表達水平最高,而GLUT4 mRNA表達水平最低。(2)與對照組相比,PCOS組子宮內膜HIF-7α和VEGF mRNA表達水平明顯降低(P0.05);而兩組間GLUT1和GLUT4 mRNA表達水平無顯著性差異(P0.05)。(3)PCOS患者中,C2組子宮內膜的HIF-1α和VEGF mRNA表達水平明顯低于C1組(P0.05),而GLUT1和GLUT4 mRNA表達水平無顯著差異(P0.05)。(4)非PCOS患者中,D2組子宮內膜的HIF-1α、VEGF、GLUT1 mRNA表達水平明顯低于D1組(P0.05),而GLUT4 mRNA表達水平無顯著差異(P0.05)。(5)肥胖型患者中,與D2組相比,C2組子宮內膜的HIF-1αmRNA表達水平明顯下降,而GLUT1 mRNA表達水平明顯升高(P0.05),VEGF mRNA的表達水平呈下降趨勢,但無顯著差異(P0.05)。3.免疫組化結果(1)HE染色結果:PCOS組和對照組的子宮內膜均為分泌期內膜。(2)PCOS組和對照組中,HIF-1α和VEGF均在子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞的胞核內呈強表達(棕黃色顆粒)。PCOS組,GLUT1和GLUT4在子宮內膜腺上皮細胞的胞核內呈強染色;而對照組中,兩者在子宮內膜腺上皮細胞的胞膜上呈強染色。(3)與對照組相比,PCOS組子宮內膜的HIF-1α和VEGF蛋白表達水平明顯降低(P0.05);而兩組間GLUT1和GLUT4的蛋白表達水平無顯著性差異(P0.05)。(4)PCOS患者中,C2組子宮內膜的HIF-1α和VEGF蛋白表達水平明顯低于C1組(P0.05),而GLUT1和GLUT4的蛋白表達水平無顯著差異(P0.05)。(5)非PCOS患者中,D2組子宮內膜的HIF-1α、VEGF、GLUT1蛋白表達水平明顯低于D1組(P0.05),而GLUT4的蛋白表達水平無顯著差異(P0.05)。(6)肥胖型患者中,與D2組相比,C2組子宮內膜的VEGF蛋白表達水平明顯下降(P0.05),HIF-1α、GLUT1和GLUT4蛋白表達水平均呈下降趨勢,但無顯著差異(P0.05)。研究結論1、著床期子宮內膜HIF-1α mRNA和蛋白均呈高表達,提示胚胎著床期子宮內膜處于低氧微環(huán)境,表明HIF-1α對子宮內膜容受性具有重要的調控作用。2、與非PCOS患者相比,PCOS患者著床期子宮內膜的HIF-Iα和VEGF mRNA和蛋白表達水平明顯下降,提示PCOS患者子宮內膜的低氧微環(huán)境可能受損,影響HIF-1α的激活及其靶基因VEGF的表達,破壞著床期子宮內膜血管網的建立。3、與非PCOS患者相比,PCOS患者的著床期子宮內膜GLUT1和GLUT4 mRNA和蛋白表達水平無明顯改變,但免疫定位表達發(fā)生了改變,可能影響子宮內膜細胞葡萄糖的攝入及蛻膜化的發(fā)生。4、與正常體重型相比,肥胖型PCOS和非PCOS患者,著床期子宮內膜的HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達水平均明顯下降,提示肥胖影響子宮內膜容受性的建立,尤其是對肥胖型PCOS患者的影響作用更明顯。
【圖文】：

．．．．Ｄ１：正常體重組；Ｄ２：肥胖組；Ｖ＜０．０５，與Ｄ１組相比，有統(tǒng)計學差異；ＮＳ：逡逑無統(tǒng)計學差異。逡逑表２－１邋ＰＣＯＳ和對照組子宮內膜等基因ｍＲＮＡ表達的比較逡逑ＰＣＯＳ組邐對照組邐尸值逡逑ＨｌＦ－ｌａ邐０．０８０邋±０．００４＊邐０．１００邐士邋０．００４邐．０４０逡逑ＶＥＧＦ邐０．０１０邋±０．００１＊邐０．０１４邐±０．００１邐．０４５逡逑ＧＬＵＴ１邐０．０２８邋土邋０．００２邐０．０２２邐土邋０．００１邐ＮＳ逡逑ＧＬＵＴ４邐０．００１３邋±０．０００１邐０．００１１邐±０．０００１邐ＮＳ逡逑＞＜邋０．０５，，與對照組相比有統(tǒng)計學差異。逡逑

邐ＧＬＵＴ１邐ＧＬＵＴ４逡逑圖２－１邋ＰＣＯＳ和對照組著床期子宮內膜ＧＬｔ／７７、逡逑ｍＲＮＡ表達水平的比較（＊尸＜０．０５，有統(tǒng)計學差異）逡逑５１逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8;R589.2;R711.75

【參考文獻】

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本文編號：2650130