【摘要】：研究目的及背景:卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,漿液性卵巢癌(SOC)占卵巢上皮癌絕大部分,其中高級(jí)別漿液性癌,惡性程度較高,預(yù)后較差。卵巢癌患者經(jīng)治療后,往往存在化療復(fù)發(fā)、多重耐藥的情況。因此,研究卵巢癌發(fā)病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)尤為重要,可以為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療打下基礎(chǔ)。CYC1(Cytochrome c-1)是線粒體復(fù)合體III的重要亞單位,在生物氧化過程中,可發(fā)生組織氧化還原的迅速酶促作用。CYC1在乳腺導(dǎo)管原位癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤等癌癥中均高表達(dá)。CYC1可參與線粒體依賴的凋亡途徑,抑制AMPK的活化,促進(jìn)腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移。本研究通過基因表達(dá)譜測(cè)序和蛋白質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌中CYC1表達(dá)明顯高于輸卵管傘,利用組織芯片TMA發(fā)現(xiàn)CYC1高表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)。通過一系列的功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CYC1的功能,發(fā)現(xiàn)其在SOC中發(fā)揮促腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、增殖、調(diào)控細(xì)胞周期和化療耐藥作用。同時(shí)通過高通量測(cè)序技術(shù),發(fā)掘了 CYC1的發(fā)揮功能下游分子機(jī)制,探討了其潛在結(jié)合的分子及相關(guān)信號(hào)通路。研究方法:1.收集正常輸卵管傘(FT)及漿液性卵巢癌(SOC)組織,RT-qPCR和Western Blot檢測(cè)組織中CYC1表達(dá)。對(duì)組織芯片(3張)免疫組化染色,統(tǒng)計(jì)CYC1的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系。2.構(gòu)建CYC1過表達(dá)及降表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期及EMT相關(guān)蛋白。3.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一定濃度梯度的順鉑、奧拉帕尼刺激,檢測(cè)CYC1蛋白表達(dá)量,MTT法測(cè)細(xì)胞增殖能力,平板克隆驗(yàn)證細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。TUNEL法與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合,檢測(cè)CYC1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。4.RNA-seq法尋找CYC1發(fā)揮功能的下游分子機(jī)制,對(duì)豐度較高的基因進(jìn)行Western Blot 及 RT-qPCR 驗(yàn)證。研究結(jié)果:1.CYC1在SOC中mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于輸卵管傘,TCGA數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)CYC1在的SOC中存在異常拷貝數(shù)擴(kuò)增,拷貝數(shù)的擴(kuò)增與CYC1的蛋白和mRNA的表達(dá)相關(guān)。2.通過免疫組織化學(xué)分析TMA中CYC1的表達(dá)水平,CYC1高表達(dá)患者總生存期短,CYC1高表達(dá)與SOC的不良預(yù)后相關(guān)。3.CYC1增強(qiáng)SOC細(xì)胞的增殖能力,通過MTT生長(zhǎng)曲線及平板克隆實(shí)驗(yàn),證明過表達(dá)CYC1促進(jìn)細(xì)胞增殖,干擾CYC1后抑制細(xì)胞增殖。降表達(dá)CYC1阻滯細(xì)胞在G1→S期,CYC1過表達(dá)則引起G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。干擾CYC1后,抑制周期相關(guān)蛋白CCNB1、CCNE1、CDKs表達(dá),而促進(jìn)p21,p27依賴性激酶抑制劑蛋白。4.CYC1促進(jìn)漿液性卵巢癌細(xì)胞的侵襲遷移能力,降表達(dá)CYC1,減弱HO8910細(xì)胞和A2780細(xì)胞的侵襲、遷移能力,過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移能力。干擾CYC1后,上皮性蛋白標(biāo)志物表達(dá)升高,間質(zhì)性蛋白標(biāo)志物表達(dá)降低,EMT相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子MMP9、Snail、Slug表達(dá)均降低。5.CYC1的高表達(dá)促進(jìn)人卵巢癌皮下移植瘤生長(zhǎng),CYC1過表達(dá)組瘤體平均重量顯著高于對(duì)照組,免疫組化染色表明CYC1過表達(dá)組中細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)增加。6.CYC1促進(jìn)SOC化療耐藥,順鉑處理明顯提高CYC1蛋白表達(dá)水平,耐藥MTT實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)CYC1,促進(jìn)A2780、SKOV3和HO8910細(xì)胞增殖;平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示,干擾CYC1降低細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)活力。降表達(dá)CYC1后,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增高,早期及晚期凋亡細(xì)胞增加,說(shuō)明CYC1通過抑制凋亡發(fā)揮耐藥作用。7.沉默CYC1增敏奧拉帕尼對(duì)BRCA野生型卵巢癌細(xì)胞作用,在SKOV3和A2780細(xì)胞中,奧拉帕尼處理?xiàng)l件下,降表達(dá)CYC1明顯降低細(xì)胞存活率。8.RNA-Seq測(cè)序結(jié)果顯示,CYC1調(diào)控多種重要通路下游分子表達(dá)。RT-q PCR結(jié)果表明,A2780細(xì)胞中干擾CYC1后,CCNE2和BIRC3表達(dá)顯著下降,此外,FGF18、EGFR、WNT5B、NFKBIA 和 FZD4 表達(dá)均有下降。Western Blot表明降表達(dá)CYC1后,CCNE2和BIRC3蛋白表達(dá)量降低。研究結(jié)論:1.CYC1在漿液性卵巢癌中表達(dá)明顯高于輸卵管傘,與SOC不良預(yù)后相關(guān)。2.CYC1作為卵巢癌不良預(yù)后因子,促進(jìn)漿液性卵巢癌的惡性生物學(xué)行為,是卵巢癌潛在治療靶點(diǎn)。3.CYC1促進(jìn)SOC對(duì)化療耐藥,降表達(dá)CYC1可以增加化療作用敏感性。4.CYC1通過調(diào)控CCNE2和BIRC3等多種重要分子發(fā)揮促癌作用。
【圖文】：

圖１．漿液性卵巢癌中ＣＹＣ１氋表達(dá)逡逑（Ａ－Ｂ）ＣＹＣｌ蛋白在Ｓ０Ｃ中的組織表達(dá)，，與輸卵管傘相比增高。（Ｃ）卵巢癌細(xì)胞逡逑系中ＣＹＣ１蛋白表達(dá)ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析。（Ｄ）ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測(cè)ＣＹＣ１在ＨＧＳ０Ｃ逡逑及輸卵管傘中的ｍＲＮＡ水平的表達(dá)。（Ｅ）邋Ｏｎｃｏｍｉｎｅ數(shù)據(jù)庫(kù)中ＣＹＣ１邋ｍＲＮＡ水逡逑平差異。分為漿液性卵巢癌、卵巢表面漿液性乳頭狀癌組，對(duì)照為正常腹膜和正逡逑常卵巢表面上皮。（Ｆ）ＣＹＣ１表達(dá)量在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)中分析，正常上皮組表達(dá)量逡逑小于漿液性卵巢癌組（Ｐ＜0．0５）。逡逑４０逡逑

圖２．ＣＹＣ１拷貝數(shù)的擴(kuò)增與其表達(dá)相關(guān)逡逑（Ａ）ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)分析ＣＹＣｌ在漿液性卵巢癌中拷貝數(shù)的變化。（Ｂ）邋ＣＹＣｌ拷貝逡逑數(shù)變化在蛋白水平和ｍＲＮＡ水平的相關(guān)性，ＣＹＣ１拷貝數(shù)變化以擴(kuò)增型為主。（Ｃ）逡逑ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)分析ＣＹＣｌ拷貝數(shù)變化類型與ｍＲＮＡ及蛋白表達(dá)的相關(guān)性。逡逑（Ｄ－Ｅ）ＣＣＬＥ數(shù)據(jù)集分析ＣＹＣｌ在卵巢癌４７種細(xì)胞系中，拷貝數(shù)變化與ｍＲＮＡ及逡逑蛋白表達(dá)相關(guān)性（ｒ＝０．６２５７，邋ｐ＜０．００ｌ）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2649178