【摘要】：研究背景宮頸癌作為常見的婦科腫瘤之一,嚴重威脅著女性的生命和健康�；熓侵委煂m頸癌的重要方法,一些化療藥物通過誘發(fā)DNA斷裂損傷,殺滅腫瘤細胞。DNA雙鏈斷裂(Double strand break,DSB)損傷是最嚴重的DNA斷裂損傷之一,腫瘤細胞對DSB損傷的修復(fù)可增強腫瘤對化療的耐受性,造成腫瘤預(yù)后不良。高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌主要的致病因素,其中HPV-16最為常見。HPV編碼6種早期蛋白和2種晚期蛋白,其中早期蛋白E6、E7是主要的癌蛋白,參與調(diào)節(jié)宮頸上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的多種生理活動,如細胞增殖,凋亡,遷移和侵襲,維持基因組穩(wěn)定性。關(guān)于E7調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)的研究仍存在爭議,有報道發(fā)現(xiàn)HPV-16E7上調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,如ATM、Chk2等的表達,從而促進DNA損傷修復(fù)。也有研究表明HPV-16E7延長細胞核內(nèi)γH2AX多聚體的存在,抑制DSB損傷修復(fù)。HPV-16E7對DSB損傷修復(fù)的作用及其分子機制有待進一步探究。Sirtuin7(SIRT7),Sirtuins家族的一員,是一類NAD(+)依賴的組蛋白去乙�；�,它在多種生理和病理過程包括DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定性中都發(fā)揮重要作用。已有報道和我們的初步研究結(jié)果顯示,HPV-16E7上調(diào)SIRT7表達,而SIRT7是否參與HPV-16E7對DSB損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)還不明確。MRN(Mre11-Rad50-Nbsl)復(fù)合物在DNA復(fù)制、細胞周期調(diào)控、端粒維持和維持基因組穩(wěn)定性等過程中有廣泛作用,在DSB損傷過程中可以識別DNA斷裂點,招募并激活修復(fù)相關(guān)蛋白ATM等。研究表明Sirtuins家族成員SIRT1可以去乙�；揎桸bs1從而促進MRN復(fù)合物的形成,且BioGRID數(shù)據(jù)庫顯示Mre11可能與SIRT7存在相互作用,因此我們推斷HPV-16E7通過上調(diào)SIRT7表達,去乙�；疢re11來影響DSB損傷修復(fù),但SIRT7對Mre11激活和MRN復(fù)合物形成的影響有待深入研究。研究目的研究SIRT7在HPV-16E7調(diào)控DSB損傷修復(fù)中的作用及其分子機制。研究方法與結(jié)果1.HPV-16E7在低水平DSB損傷下促進修復(fù),在高水平DSB損傷下抑制修復(fù)Western Blot 檢測結(jié)果顯示,用包裝 HPV-16E7 過表達載體(pBabe-HPV-16E7)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的HaCat細胞,與感染對照組(pBabe-puro)相比,HPV-16E7和p53蛋白表達水平顯著上調(diào)。流式細胞和中性彗星試驗顯示,用10μg/ml博來霉素處理細胞0.5h并釋放1h后,實驗組中γH2AX多聚體明顯減少,尾矩(olive tail moment,OTM)明顯降低;而20μg/ml博來霉素處理細胞0.5h并釋放1h后,實驗組中γH2AX多聚體明顯增多且OTM升高。檢測修復(fù)相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示,HPV-16E7在低劑量博來霉素誘導(dǎo)下促進修復(fù)蛋白pBRCA1(同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白)、XRCC4(非同源末端連接相關(guān)蛋白)的表達,而在高劑量下抑制修復(fù)蛋白的表達。2.HPV-16E7通過調(diào)節(jié)SIRT7表達影響DSB損傷修復(fù)實時熒光定量 PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和Western Blot結(jié)果顯示,HPV-16E7在低水平DSB損傷時上調(diào)SIRT7的mRNA和蛋白表達水平,而在高水平DSB損傷時下調(diào)SIRT7表達。用siRNA-SIRT7轉(zhuǎn)染過表達HPV-16E7的HaCat細胞及對照細胞,加入不同濃度博來霉素處理0.5h并釋放1h。流式細胞實驗和中性彗星實驗發(fā)現(xiàn),與siRNA對照組(siRNA-negative control)相比,siRNA-SIRT7組的yH2AX多聚體增多且OTM升高,說明敲低SIRT7能夠部分逆轉(zhuǎn)HPV-16E7對DSB損傷修復(fù)的影響。Western Blot實驗結(jié)果顯示,siRNA-SIRT7能夠上調(diào)pBRCA1而下調(diào)XRCC4的表達。3.上調(diào)SIRT7的表達促進DSB損傷修復(fù),下調(diào)SIRT7的表達抑制DSB損傷修復(fù)在HaCat細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-SIRT7質(zhì)粒,加入不同濃度博來霉素處理0.5h并釋放1h后,收集細胞進行yH2AX流式細胞和中性彗星實驗檢測,結(jié)果顯示,過表達SIRT7能夠促進細胞DSB損傷修復(fù)。Western Blot結(jié)果顯示,過表達SIRT7上調(diào)XRCC4的表達而下調(diào)pBRCA1的表達。Western Blot檢測證明包裝shRNA-SIRT7的慢病毒感染可有效下調(diào)HaCat細胞中SIRT7的蛋白水平。γH2AX流式細胞和中性彗星實驗結(jié)果顯示,相較于對照組,shRNA-SIRT7組DSB損傷水平明顯升高。修復(fù)相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果顯示,敲低SIRT7可上調(diào)pBRCA1的表達而下調(diào)XRCC4的表達。4.回復(fù)表達SIRT7(wt)促進DSB損傷修復(fù)在敲低SIRT7的細胞中通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染回復(fù)表達野生型SIRT7(wt)和不具有去乙�；钚缘耐蛔冃蚐IRT7(H187Y),用不同濃度的博來霉素處理細胞0.5h并釋放1h后,通過yH2AX流式細胞術(shù)和中性彗星實驗檢測細胞的DSB損傷水平,結(jié)果顯示SIRT7(wt)回復(fù)表達能夠降低DSB損傷水平,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。Western Blot結(jié)果表明,SIRT7(wt)促進XRCC4的表達而抑制pBRCA1的表達,SIRT7(H187Y)則不具有這種功能。5.SIRT7去乙�；疢re11,從而促進Mre11磷酸化和MRN復(fù)合物形成免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)實驗結(jié)果表明,SIRT7能夠共沉淀Mre11 且Mre11 能夠共沉淀SIRT7。免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)結(jié)果顯示:shRNA-SIRT7介導(dǎo)的SIRT7下調(diào)增加了 Mre11乙�；�,并抑制Mre11 676位絲氨酸(Ser676)磷酸化;回復(fù)表達SIRT7(wt)能夠部分逆轉(zhuǎn)敲低SIRT7對Mre11乙�；土姿峄挠绊�,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。免疫熒光染色和Co-IP結(jié)果顯示,敲低SIRT7能夠抑制MRN復(fù)合物三種成分的共定位和共沉淀,回復(fù)表達SIRT7(wt)可部分逆轉(zhuǎn)敲低SIRT7對MRN復(fù)合物形成的影響,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。研究結(jié)論1.低水平DSB損傷時,HPV-16E7促進DNA修復(fù);高水平DSB損傷時,HPV-16E7抑制DNA修復(fù)。2.HPV-16E7通過調(diào)節(jié)SIRT7的表達影響DSB損傷修復(fù)。低水平DSB損傷時,HPV-16E7上調(diào)SIRT7的表達,而高水平DSB損傷時,HPV-16E7下調(diào)SIRT7的表達。3.SIRT7去乙�；疢re11,從而促進其Ser676磷酸化和MRN復(fù)合物的形成,并促進DSB損傷修復(fù)。
【圖文】：

逡逑胞損傷程度，而釋放ｌｈ后的結(jié)果反映細胞ＤＳＢ修復(fù)水平。如圖２Ａ和２Ｂ結(jié)果逡逑顯示：低劑量博來霉素加藥并釋放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７細胞ＤＳＢ?lián)p傷相對較輕；逡逑而高劑量博來霉素加藥并釋放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７細胞ＤＳＢ?lián)p傷程度相對較重。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測修復(fù)相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示ＨＰＶ－１６Ｅ７在低水平ＤＳＢ?lián)p傷逡逑情況下促進修復(fù)蛋白（ｐＢＲＣＡｌ、ＸＲＣＣ４）的表達，高水平ＤＳＢ?lián)p傷情況下抑逡逑制ｐＢＲＣＡｌ表達且延遲ＸＲＣＣ４表達（圖２Ｃ）。逡逑加丨）邐０邐１０邐１０邐０邐２０邐２０邐（０．５ｈ）逡逑ｒｅｌｅａｓｅ邋ｔｉｍａｊｈ｝邐０邐０邐１邐０邐０邐１逡逑１0邋０．２９邋ｌｂ邋８．７２Ｊ邋％邐０．２３Ｊ邐１１．５邐？０邐１０．７一逡逑Ｈａｃａ＂ＰＢａｂ＊逡逑■］０邐１邐９９．７邐－０邐９１．３邐０邐８６．５邐０邐９９．８邐－＊＇０邐８８．５邐０邐８９．３逡逑ｘ邐：．邐■邐■邐■邐ｉ邐邋邐邋，，邐邐邐邋邐邐邐邐邐邋．．邐．．．．邐逡逑？邋Ｍ＊邐Ａｔｍ邋■＃）？＊邐－？？？．邐ｍ－．邋ｍｍ邋Ｍｍ邋ｍｍ＊邐？＊邐？＊＊＊邋＾邐？？邐？＊邋ｖｉｍ邐ｍｃ＊邐ｉｍ邋＊ｍ邐ｙｍ邋ｗ邋ｍ？逡逑Ｘ邐＜Ｓ＊４邐ｆＸｔＡ：逡逑爸逡逑—�。妫掊义希斑姡梗福惯�？ｉ0邐９０．７邐０邐９０．１邐＾）０邐９８．７邐：０邐ｊ邋９１．１邐ｖｊ0邐８５．８逡逑Ｌ＿＞，＿＿，＿＿邐，￣￣￣Ｉ邐Ｕ．．．Ｔ＿＿

Ａ．邋７Ｈ２ＡＸ流式細胞術(shù)檢測經(jīng)不同濃度博來霉素處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對照細胞逡逑中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對ＤＳＢ?lián)p傷的影響；Ｂ．中性彗星實驗檢測經(jīng)不同濃度博來霉素逡逑處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對照細胞中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對ＤＳＢ?lián)p傷的影響；Ｃ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑檢測經(jīng)不同濃度博來霉素處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對照細胞中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對修復(fù)逡逑相關(guān)蛋白表達的影響。逡逑４２逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33

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本文編號：2644673