【摘要】：研究背景宮頸癌作為常見的婦科腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著女性的生命和健康。化療是治療宮頸癌的重要方法,一些化療藥物通過誘發(fā)DNA斷裂損傷,殺滅腫瘤細(xì)胞。DNA雙鏈斷裂(Double strand break,DSB)損傷是最嚴(yán)重的DNA斷裂損傷之一,腫瘤細(xì)胞對(duì)DSB損傷的修復(fù)可增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療的耐受性,造成腫瘤預(yù)后不良。高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌主要的致病因素,其中HPV-16最為常見。HPV編碼6種早期蛋白和2種晚期蛋白,其中早期蛋白E6、E7是主要的癌蛋白,參與調(diào)節(jié)宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的多種生理活動(dòng),如細(xì)胞增殖,凋亡,遷移和侵襲,維持基因組穩(wěn)定性。關(guān)于E7調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)的研究仍存在爭(zhēng)議,有報(bào)道發(fā)現(xiàn)HPV-16E7上調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,如ATM、Chk2等的表達(dá),從而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。也有研究表明HPV-16E7延長(zhǎng)細(xì)胞核內(nèi)γH2AX多聚體的存在,抑制DSB損傷修復(fù)。HPV-16E7對(duì)DSB損傷修復(fù)的作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。Sirtuin7(SIRT7),Sirtuins家族的一員,是一類NAD(+)依賴的組蛋白去乙酰化酶,它在多種生理和病理過程包括DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定性中都發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道和我們的初步研究結(jié)果顯示,HPV-16E7上調(diào)SIRT7表達(dá),而SIRT7是否參與HPV-16E7對(duì)DSB損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)還不明確。MRN(Mre11-Rad50-Nbsl)復(fù)合物在DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控、端粒維持和維持基因組穩(wěn)定性等過程中有廣泛作用,在DSB損傷過程中可以識(shí)別DNA斷裂點(diǎn),招募并激活修復(fù)相關(guān)蛋白ATM等。研究表明Sirtuins家族成員SIRT1可以去乙酰化修飾Nbs1從而促進(jìn)MRN復(fù)合物的形成,且BioGRID數(shù)據(jù)庫顯示Mre11可能與SIRT7存在相互作用,因此我們推斷HPV-16E7通過上調(diào)SIRT7表達(dá),去乙�；疢re11來影響DSB損傷修復(fù),但SIRT7對(duì)Mre11激活和MRN復(fù)合物形成的影響有待深入研究。研究目的研究SIRT7在HPV-16E7調(diào)控DSB損傷修復(fù)中的作用及其分子機(jī)制。研究方法與結(jié)果1.HPV-16E7在低水平DSB損傷下促進(jìn)修復(fù),在高水平DSB損傷下抑制修復(fù)Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,用包裝 HPV-16E7 過表達(dá)載體(pBabe-HPV-16E7)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的HaCat細(xì)胞,與感染對(duì)照組(pBabe-puro)相比,HPV-16E7和p53蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。流式細(xì)胞和中性彗星試驗(yàn)顯示,用10μg/ml博來霉素處理細(xì)胞0.5h并釋放1h后,實(shí)驗(yàn)組中γH2AX多聚體明顯減少,尾矩(olive tail moment,OTM)明顯降低;而20μg/ml博來霉素處理細(xì)胞0.5h并釋放1h后,實(shí)驗(yàn)組中γH2AX多聚體明顯增多且OTM升高。檢測(cè)修復(fù)相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示,HPV-16E7在低劑量博來霉素誘導(dǎo)下促進(jìn)修復(fù)蛋白pBRCA1(同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白)、XRCC4(非同源末端連接相關(guān)蛋白)的表達(dá),而在高劑量下抑制修復(fù)蛋白的表達(dá)。2.HPV-16E7通過調(diào)節(jié)SIRT7表達(dá)影響DSB損傷修復(fù)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和Western Blot結(jié)果顯示,HPV-16E7在低水平DSB損傷時(shí)上調(diào)SIRT7的mRNA和蛋白表達(dá)水平,而在高水平DSB損傷時(shí)下調(diào)SIRT7表達(dá)。用siRNA-SIRT7轉(zhuǎn)染過表達(dá)HPV-16E7的HaCat細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞,加入不同濃度博來霉素處理0.5h并釋放1h。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和中性彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與siRNA對(duì)照組(siRNA-negative control)相比,siRNA-SIRT7組的yH2AX多聚體增多且OTM升高,說明敲低SIRT7能夠部分逆轉(zhuǎn)HPV-16E7對(duì)DSB損傷修復(fù)的影響。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA-SIRT7能夠上調(diào)pBRCA1而下調(diào)XRCC4的表達(dá)。3.上調(diào)SIRT7的表達(dá)促進(jìn)DSB損傷修復(fù),下調(diào)SIRT7的表達(dá)抑制DSB損傷修復(fù)在HaCat細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-SIRT7質(zhì)粒,加入不同濃度博來霉素處理0.5h并釋放1h后,收集細(xì)胞進(jìn)行yH2AX流式細(xì)胞和中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果顯示,過表達(dá)SIRT7能夠促進(jìn)細(xì)胞DSB損傷修復(fù)。Western Blot結(jié)果顯示,過表達(dá)SIRT7上調(diào)XRCC4的表達(dá)而下調(diào)pBRCA1的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)證明包裝shRNA-SIRT7的慢病毒感染可有效下調(diào)HaCat細(xì)胞中SIRT7的蛋白水平。γH2AX流式細(xì)胞和中性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較于對(duì)照組,shRNA-SIRT7組DSB損傷水平明顯升高。修復(fù)相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示,敲低SIRT7可上調(diào)pBRCA1的表達(dá)而下調(diào)XRCC4的表達(dá)。4.回復(fù)表達(dá)SIRT7(wt)促進(jìn)DSB損傷修復(fù)在敲低SIRT7的細(xì)胞中通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染回復(fù)表達(dá)野生型SIRT7(wt)和不具有去乙�；钚缘耐蛔冃蚐IRT7(H187Y),用不同濃度的博來霉素處理細(xì)胞0.5h并釋放1h后,通過yH2AX流式細(xì)胞術(shù)和中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的DSB損傷水平,結(jié)果顯示SIRT7(wt)回復(fù)表達(dá)能夠降低DSB損傷水平,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。Western Blot結(jié)果表明,SIRT7(wt)促進(jìn)XRCC4的表達(dá)而抑制pBRCA1的表達(dá),SIRT7(H187Y)則不具有這種功能。5.SIRT7去乙�；疢re11,從而促進(jìn)Mre11磷酸化和MRN復(fù)合物形成免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SIRT7能夠共沉淀Mre11 且Mre11 能夠共沉淀SIRT7。免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)結(jié)果顯示:shRNA-SIRT7介導(dǎo)的SIRT7下調(diào)增加了 Mre11乙酰化水平,并抑制Mre11 676位絲氨酸(Ser676)磷酸化;回復(fù)表達(dá)SIRT7(wt)能夠部分逆轉(zhuǎn)敲低SIRT7對(duì)Mre11乙�；土姿峄挠绊�,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。免疫熒光染色和Co-IP結(jié)果顯示,敲低SIRT7能夠抑制MRN復(fù)合物三種成分的共定位和共沉淀,回復(fù)表達(dá)SIRT7(wt)可部分逆轉(zhuǎn)敲低SIRT7對(duì)MRN復(fù)合物形成的影響,而SIRT7(H187Y)不具有這種功能。研究結(jié)論1.低水平DSB損傷時(shí),HPV-16E7促進(jìn)DNA修復(fù);高水平DSB損傷時(shí),HPV-16E7抑制DNA修復(fù)。2.HPV-16E7通過調(diào)節(jié)SIRT7的表達(dá)影響DSB損傷修復(fù)。低水平DSB損傷時(shí),HPV-16E7上調(diào)SIRT7的表達(dá),而高水平DSB損傷時(shí),HPV-16E7下調(diào)SIRT7的表達(dá)。3.SIRT7去乙�；疢re11,從而促進(jìn)其Ser676磷酸化和MRN復(fù)合物的形成,并促進(jìn)DSB損傷修復(fù)。
【圖文】：

逡逑胞損傷程度，而釋放ｌｈ后的結(jié)果反映細(xì)胞ＤＳＢ修復(fù)水平。如圖２Ａ和２Ｂ結(jié)果逡逑顯示：低劑量博來霉素加藥并釋放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７細(xì)胞ＤＳＢ?lián)p傷相對(duì)較輕；逡逑而高劑量博來霉素加藥并釋放ｌｈ后，ＨａＣａｔ－１６Ｅ７細(xì)胞ＤＳＢ?lián)p傷程度相對(duì)較重。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示ＨＰＶ－１６Ｅ７在低水平ＤＳＢ?lián)p傷逡逑情況下促進(jìn)修復(fù)蛋白（ｐＢＲＣＡｌ、ＸＲＣＣ４）的表達(dá)，高水平ＤＳＢ?lián)p傷情況下抑逡逑制ｐＢＲＣＡｌ表達(dá)且延遲ＸＲＣＣ４表達(dá)（圖２Ｃ）。逡逑加丨）邐０邐１０邐１０邐０邐２０邐２０邐（０．５ｈ）逡逑ｒｅｌｅａｓｅ邋ｔｉｍａｊｈ｝邐０邐０邐１邐０邐０邐１逡逑１0邋０．２９邋ｌｂ邋８．７２Ｊ邋％邐０．２３Ｊ邐１１．５邐？０邐１０．７一逡逑Ｈａｃａ＂ＰＢａｂ＊逡逑■］０邐１邐９９．７邐－０邐９１．３邐０邐８６．５邐０邐９９．８邐－＊＇０邐８８．５邐０邐８９．３逡逑ｘ邐：．邐■邐■邐■邐ｉ邐邋邐邋，，邐邐邐邋邐邐邐邐邐邋．．邐．．．．邐逡逑？邋Ｍ＊邐Ａｔｍ邋■＃）？＊邐－？？？．邐ｍ－．邋ｍｍ邋Ｍｍ邋ｍｍ＊邐？＊邐？＊＊＊邋＾邐？？邐？＊邋ｖｉｍ邐ｍｃ＊邐ｉｍ邋＊ｍ邐ｙｍ邋ｗ邋ｍ？逡逑Ｘ邐＜Ｓ＊４邐ｆＸｔＡ：逡逑爸逡逑—�。妫掊义希斑姡梗福惯�？ｉ0邐９０．７邐０邐９０．１邐＾）０邐９８．７邐：０邐ｊ邋９１．１邐ｖｊ0邐８５．８逡逑Ｌ＿＞，＿＿，＿＿邐，￣￣￣Ｉ邐Ｕ．．．Ｔ＿＿

Ａ．邋７Ｈ２ＡＸ流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)不同濃度博來霉素處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對(duì)照細(xì)胞逡逑中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對(duì)ＤＳＢ?lián)p傷的影響；Ｂ．中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)不同濃度博來霉素逡逑處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對(duì)照細(xì)胞中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對(duì)ＤＳＢ?lián)p傷的影響；Ｃ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑檢測(cè)經(jīng)不同濃度博來霉素處理的ＨａＣａｔ－１６Ｅ７和對(duì)照細(xì)胞中，ＳＩＲＴ７下調(diào)對(duì)修復(fù)逡逑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。逡逑４２逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2644673