【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer,OC)是婦科系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中上皮卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是OC最主要的病理類(lèi)型,占OC的85%。由于OC易耐藥轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),致使其病死率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位。傳統(tǒng)的治療效果并不理想,就其原因是腫瘤組織中存在小部分的腫瘤干細(xì)胞或癌干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC),其具有無(wú)限增殖、自我更新、分化及耐受放化療等能力,是腫瘤拮抗放化療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此,尋找新的治療策略治療OC是至關(guān)重要的。近年來(lái),隨著腫瘤免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子技術(shù)等研究不斷深入,腫瘤免疫治療逐漸興起。腫瘤免疫治療是通過(guò)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫應(yīng)答,充分發(fā)揮其抑制和殺傷腫瘤功能的治療方法。目前腫瘤免疫治療主要包括免疫檢測(cè)點(diǎn)阻斷、過(guò)繼性輸注免疫活性細(xì)胞和腫瘤疫苗等,經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用已經(jīng)證實(shí)這些治療能夠較為明顯的改善疾病預(yù)后。然而,由于CSC及其分化的子代所表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜系繼而表達(dá)出不同的抗原,所以普通的腫瘤免疫治療并不能有效地殺滅CSC,可導(dǎo)致CSC殘余富集。因此,有效靶向CSC的免疫治療是消滅腫瘤、防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。目前,有觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為CSC富集多種的腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原,以完整的CSC的裂解產(chǎn)物作為腫瘤免疫的疫苗,可能會(huì)激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性靶向CSC的免疫反應(yīng)。因此,卵巢癌CSC疫苗是一個(gè)值得研究的免疫治療策略。本研究選擇小鼠上皮卵巢癌細(xì)胞系ID8細(xì)胞,通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)法(serum free medium,SFM)富集并鑒定細(xì)胞系ID8的卵巢癌干樣細(xì)胞(OCSC)。然后將富集的ID8 OCSC制備成疫苗免疫C57BL/6小鼠,研究其抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制。目的:分選鑒定鼠源性上皮卵巢癌細(xì)胞系ID8的OCSC,并以此為基礎(chǔ),探討OCSC瘤苗抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制,為以O(shè)CSC瘤苗治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.應(yīng)用SFM培養(yǎng)小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞,將獲得ID8懸浮球細(xì)胞傳代擴(kuò)增。體外采用CCK8法、平板克隆、Transwell小室遷移侵襲及藥敏實(shí)驗(yàn)觀(guān)察懸浮球細(xì)胞與常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞在生物學(xué)功能上的差異,并通過(guò)小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)比較兩者的體內(nèi)成瘤能力。最后應(yīng)用Real-time PCR以及Western blot檢測(cè)兩者細(xì)胞系和瘤組織中OCSC標(biāo)志乙醛脫氫酶1(ALDH1)的表達(dá)情況。2.取2×10~5個(gè)SFM培養(yǎng)的ID8 OCSC,經(jīng)反復(fù)凍融滅活后免疫C57BL/6小鼠,每次間隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6個(gè)ID8細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)ID8細(xì)胞瘤苗組為對(duì)照,以上述同樣的方法免疫和攻擊小鼠。觀(guān)察各組小鼠生存和腫瘤生長(zhǎng)情況,并通過(guò)檢測(cè)免疫小鼠血清細(xì)胞因子,補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒活性(CDC)、脾細(xì)胞及NK細(xì)胞毒活性,比較OCSC瘤苗與普通瘤苗的抗腫瘤效果差異。3.應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)ID8細(xì)胞和ID8 OCSC中的腫瘤優(yōu)勢(shì)抗原即受體酪氨酸激酶孤兒受體1型(ROR1)分子表達(dá)差異。并設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠ROR1靶基因序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)序列,構(gòu)建重組質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝,并使用倍比稀釋法測(cè)定病毒滴度。之后將含有shROR1表達(dá)載體的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞,最后應(yīng)用Real-time PCR和Western blot分析ID8細(xì)胞中ROR1分子下調(diào)情況。4.取2×10~5個(gè)SFM培養(yǎng)的shROR1-ID8 OCSC經(jīng)反復(fù)凍融滅活后免疫C57BL/6小鼠,每次間隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6個(gè)ID8細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)ID8細(xì)胞瘤苗組和ID8 OCSC瘤苗組為對(duì)照,以上述同樣的方法免疫和攻擊小鼠。觀(guān)察各組小鼠生存和腫瘤生長(zhǎng)情況,通過(guò)小鼠腫瘤生成時(shí)間及腫瘤體積的大小,初步探討OCSC瘤苗抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)制。結(jié)果:1.小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞能在SFM中形成可穩(wěn)定傳代的懸浮球細(xì)胞,其與非懸浮球細(xì)胞相比,具有較強(qiáng)的增殖、自我更新、遷移、侵襲、耐藥及致瘤的能力。同時(shí),ID8懸浮球細(xì)胞及其瘤組織中高表達(dá)CSC標(biāo)志ALDH1。2.與ID8瘤苗組相比,ID8懸浮球制備的OCSC瘤苗組的小鼠成瘤潛伏期長(zhǎng),腫瘤生長(zhǎng)速度較慢,具有顯著性的差異。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ID8 OCSC瘤苗組小鼠血清IFN-γ水平,CDC活性、脾細(xì)胞及NK細(xì)胞毒活性均較ID8瘤苗組高。同時(shí)ID8 OCSC瘤苗免疫鼠血清中TGF-β1表達(dá)明顯降低。3.ROR1分子在ID8 OCSC中高表達(dá),與ID8細(xì)胞相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序結(jié)果顯示與預(yù)期DNA序列吻合;滴度測(cè)定表明shROR1慢病毒載體構(gòu)建成功。含有shROR1慢病毒的ID8細(xì)胞中ROR1表達(dá)下降。4.應(yīng)用反復(fù)凍融法制備shROR1-ID8 OCSC瘤苗免疫C57 BL/6小鼠后,較ID8OCSC瘤苗免疫組而言,shROR1-ID8 OCSC瘤苗組小鼠成瘤時(shí)間短且腫瘤生長(zhǎng)速度快,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:應(yīng)用SFM培養(yǎng)法能有效富集具有OCSC特征的上皮卵巢癌ID8懸浮球細(xì)胞,用其制備的瘤苗,具有更強(qiáng)的免疫原性,能夠有效的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),顯示出有效的抗腫瘤效應(yīng);其效應(yīng)機(jī)制與OCSC高表達(dá)ROR1免疫分子激發(fā)小鼠強(qiáng)免疫反應(yīng)相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為以ID8 OCSC瘤苗防治卵巢癌提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

ID8細(xì)胞在SSM中呈梭型單層貼壁生長(zhǎng)，而在含有細(xì)胞因子的SFM中，部分ID8細(xì)胞懸浮增生，呈球形或者橢圓形，懸浮球內(nèi)的細(xì)胞結(jié)合緊密、球體飽滿(mǎn)且球內(nèi)細(xì)胞折光性好（圖1-1）。表明ID8細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下能夠存活并增殖形成具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞球。圖1-1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)圖（×100）Figure 1-1 The cell growth observed under microscope (×100)A：ID8細(xì)胞（ID8 cell） B：ID8懸浮球細(xì)胞 （ID8 sphere cell）2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK8法連續(xù)7天檢測(cè)ID8細(xì)胞和懸浮球細(xì)胞增殖的情況，并繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，從培養(yǎng)的第4天開(kāi)始，懸浮球細(xì)胞組的吸光值明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞組（P＜0.01，圖1-2），表明相對(duì)于ID8細(xì)胞，懸浮球細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。圖1-2 兩組細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：兩組細(xì)胞連續(xù)7天測(cè)量的OD值 B：兩組細(xì)胞連續(xù)7天增殖曲線(xiàn)圖（**p <0.01,***p <0.

采用CCK8法連續(xù)7天檢測(cè)ID8細(xì)胞和懸浮球細(xì)胞增殖的情況，并繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，，從培養(yǎng)的第4天開(kāi)始，懸浮球細(xì)胞組的吸光值明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞組（P＜0.01，圖1-2），表明相對(duì)于ID8細(xì)胞，懸浮球細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。圖1-2 兩組細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：兩組細(xì)胞連續(xù)7天測(cè)量的OD值 B：兩組細(xì)胞連續(xù)7天增殖曲線(xiàn)圖（**p <0.01,***p <0.001）
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31;R730.51

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本文編號(hào)：2643241