【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer,OC)是婦科系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其中上皮卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是OC最主要的病理類型,占OC的85%。由于OC易耐藥轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),致使其病死率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位。傳統(tǒng)的治療效果并不理想,就其原因是腫瘤組織中存在小部分的腫瘤干細(xì)胞或癌干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC),其具有無限增殖、自我更新、分化及耐受放化療等能力,是腫瘤拮抗放化療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此,尋找新的治療策略治療OC是至關(guān)重要的。近年來,隨著腫瘤免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子技術(shù)等研究不斷深入,腫瘤免疫治療逐漸興起。腫瘤免疫治療是通過激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫應(yīng)答,充分發(fā)揮其抑制和殺傷腫瘤功能的治療方法。目前腫瘤免疫治療主要包括免疫檢測點(diǎn)阻斷、過繼性輸注免疫活性細(xì)胞和腫瘤疫苗等,經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用已經(jīng)證實(shí)這些治療能夠較為明顯的改善疾病預(yù)后。然而,由于CSC及其分化的子代所表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜系繼而表達(dá)出不同的抗原,所以普通的腫瘤免疫治療并不能有效地殺滅CSC,可導(dǎo)致CSC殘余富集。因此,有效靶向CSC的免疫治療是消滅腫瘤、防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。目前,有觀點(diǎn)認(rèn)為CSC富集多種的腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原,以完整的CSC的裂解產(chǎn)物作為腫瘤免疫的疫苗,可能會激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性靶向CSC的免疫反應(yīng)。因此,卵巢癌CSC疫苗是一個(gè)值得研究的免疫治療策略。本研究選擇小鼠上皮卵巢癌細(xì)胞系ID8細(xì)胞,通過無血清培養(yǎng)法(serum free medium,SFM)富集并鑒定細(xì)胞系ID8的卵巢癌干樣細(xì)胞(OCSC)。然后將富集的ID8 OCSC制備成疫苗免疫C57BL/6小鼠,研究其抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制。目的:分選鑒定鼠源性上皮卵巢癌細(xì)胞系ID8的OCSC,并以此為基礎(chǔ),探討OCSC瘤苗抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制,為以O(shè)CSC瘤苗治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.應(yīng)用SFM培養(yǎng)小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞,將獲得ID8懸浮球細(xì)胞傳代擴(kuò)增。體外采用CCK8法、平板克隆、Transwell小室遷移侵襲及藥敏實(shí)驗(yàn)觀察懸浮球細(xì)胞與常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞在生物學(xué)功能上的差異,并通過小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)比較兩者的體內(nèi)成瘤能力。最后應(yīng)用Real-time PCR以及Western blot檢測兩者細(xì)胞系和瘤組織中OCSC標(biāo)志乙醛脫氫酶1(ALDH1)的表達(dá)情況。2.取2×10~5個(gè)SFM培養(yǎng)的ID8 OCSC,經(jīng)反復(fù)凍融滅活后免疫C57BL/6小鼠,每次間隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6個(gè)ID8細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)ID8細(xì)胞瘤苗組為對照,以上述同樣的方法免疫和攻擊小鼠。觀察各組小鼠生存和腫瘤生長情況,并通過檢測免疫小鼠血清細(xì)胞因子,補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒活性(CDC)、脾細(xì)胞及NK細(xì)胞毒活性,比較OCSC瘤苗與普通瘤苗的抗腫瘤效果差異。3.應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測ID8細(xì)胞和ID8 OCSC中的腫瘤優(yōu)勢抗原即受體酪氨酸激酶孤兒受體1型(ROR1)分子表達(dá)差異。并設(shè)計(jì)針對小鼠ROR1靶基因序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)序列,構(gòu)建重組質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝,并使用倍比稀釋法測定病毒滴度。之后將含有shROR1表達(dá)載體的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞,最后應(yīng)用Real-time PCR和Western blot分析ID8細(xì)胞中ROR1分子下調(diào)情況。4.取2×10~5個(gè)SFM培養(yǎng)的shROR1-ID8 OCSC經(jīng)反復(fù)凍融滅活后免疫C57BL/6小鼠,每次間隔10天,共免疫3次。末次免疫后第10天,以2×10~6個(gè)ID8細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)ID8細(xì)胞瘤苗組和ID8 OCSC瘤苗組為對照,以上述同樣的方法免疫和攻擊小鼠。觀察各組小鼠生存和腫瘤生長情況,通過小鼠腫瘤生成時(shí)間及腫瘤體積的大小,初步探討OCSC瘤苗抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)制。結(jié)果:1.小鼠卵巢癌ID8細(xì)胞能在SFM中形成可穩(wěn)定傳代的懸浮球細(xì)胞,其與非懸浮球細(xì)胞相比,具有較強(qiáng)的增殖、自我更新、遷移、侵襲、耐藥及致瘤的能力。同時(shí),ID8懸浮球細(xì)胞及其瘤組織中高表達(dá)CSC標(biāo)志ALDH1。2.與ID8瘤苗組相比,ID8懸浮球制備的OCSC瘤苗組的小鼠成瘤潛伏期長,腫瘤生長速度較慢,具有顯著性的差異。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)ID8 OCSC瘤苗組小鼠血清IFN-γ水平,CDC活性、脾細(xì)胞及NK細(xì)胞毒活性均較ID8瘤苗組高。同時(shí)ID8 OCSC瘤苗免疫鼠血清中TGF-β1表達(dá)明顯降低。3.ROR1分子在ID8 OCSC中高表達(dá),與ID8細(xì)胞相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果顯示與預(yù)期DNA序列吻合;滴度測定表明shROR1慢病毒載體構(gòu)建成功。含有shROR1慢病毒的ID8細(xì)胞中ROR1表達(dá)下降。4.應(yīng)用反復(fù)凍融法制備shROR1-ID8 OCSC瘤苗免疫C57 BL/6小鼠后,較ID8OCSC瘤苗免疫組而言,shROR1-ID8 OCSC瘤苗組小鼠成瘤時(shí)間短且腫瘤生長速度快,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:應(yīng)用SFM培養(yǎng)法能有效富集具有OCSC特征的上皮卵巢癌ID8懸浮球細(xì)胞,用其制備的瘤苗,具有更強(qiáng)的免疫原性,能夠有效的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),顯示出有效的抗腫瘤效應(yīng);其效應(yīng)機(jī)制與OCSC高表達(dá)ROR1免疫分子激發(fā)小鼠強(qiáng)免疫反應(yīng)相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為以ID8 OCSC瘤苗防治卵巢癌提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

ID8細(xì)胞在SSM中呈梭型單層貼壁生長，而在含有細(xì)胞因子的SFM中，部分ID8細(xì)胞懸浮增生，呈球形或者橢圓形，懸浮球內(nèi)的細(xì)胞結(jié)合緊密、球體飽滿且球內(nèi)細(xì)胞折光性好（圖1-1）。表明ID8細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下能夠存活并增殖形成具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞球。圖1-1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)圖（×100）Figure 1-1 The cell growth observed under microscope (×100)A：ID8細(xì)胞（ID8 cell） B：ID8懸浮球細(xì)胞 （ID8 sphere cell）2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK8法連續(xù)7天檢測ID8細(xì)胞和懸浮球細(xì)胞增殖的情況，并繪制出細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果顯示，從培養(yǎng)的第4天開始，懸浮球細(xì)胞組的吸光值明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞組（P＜0.01，圖1-2），表明相對于ID8細(xì)胞，懸浮球細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。圖1-2 兩組細(xì)胞增殖能力的檢測Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：兩組細(xì)胞連續(xù)7天測量的OD值 B：兩組細(xì)胞連續(xù)7天增殖曲線圖（**p <0.01,***p <0.

采用CCK8法連續(xù)7天檢測ID8細(xì)胞和懸浮球細(xì)胞增殖的情況，并繪制出細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果顯示，，從培養(yǎng)的第4天開始，懸浮球細(xì)胞組的吸光值明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的ID8細(xì)胞組（P＜0.01，圖1-2），表明相對于ID8細(xì)胞，懸浮球細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。圖1-2 兩組細(xì)胞增殖能力的檢測Figure 1-2 The proliferation ability of ID8 sphere cell and ID8 cell tested by CCK8 assayA：兩組細(xì)胞連續(xù)7天測量的OD值 B：兩組細(xì)胞連續(xù)7天增殖曲線圖（**p <0.01,***p <0.001）
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31;R730.51

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何迎春,田道法;轉(zhuǎn)基因瘤苗的研究[J];腫瘤防治雜志;2005年14期

2 ;瘤苗防癌癥復(fù)發(fā)[J];浙江中醫(yī)雜志;2000年04期

3 劉振華,彭孝偉;瘤苗的研究近況[J];癌癥;1996年04期

4 史志東;熊亮;秦忠宗;龔瑾;鄧博;郭瑛;;多基因調(diào)控的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤苗的制備[J];臨床醫(yī)學(xué)工程;2010年03期

5 王文慧,陳治龍;自體瘤苗的研究進(jìn)展[J];北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年01期

6 任林廣,王雪寶,陳忠民;肝癌(H_(22))固化瘤苗對荷瘤小鼠的主動免疫作用[J];實(shí)用腫瘤學(xué)雜志;1998年04期

7 王明吉,王麗娜,李淑英,韓春,石桂秀,林麗珠,吳桂剛;10例慢性粒細(xì)胞白血病自體瘤苗治療前后免疫指標(biāo)的變化和臨床療效觀察[J];醫(yī)師進(jìn)修雜志;1999年12期

8 黃卓正,李挺;自體瘤苗綜合治療原發(fā)性肝癌12例臨床報(bào)告[J];實(shí)用癌癥雜志;1999年04期

9 黃皎琳;高溫—固化瘤苗研究新進(jìn)展[J];中國腫瘤臨床;1997年01期

10 何向鋒;施文;趙楓姝;譚清和;王建紅;陳登宇;曹文虎;竇駿;;米托蒽醌處理B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗特征及其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)初探[J];中國癌癥雜志;2012年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李寧;覃漢軍;周春霞;王冬梅;馬文波;林晨;張叔人;;前列腺癌趨化抗原基因修飾瘤苗研究[A];第四屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

2 易平勇;余海;馬文學(xué);王青青;;雙重免疫分子膜表面修飾瘤苗的制備及抗腫瘤作用的研究[A];第三屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會教育論文集[C];2004年

3 余建法;葉圣雅;;惡性腫瘤的瘤苗治療[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會普通外科專業(yè)委員會第九次學(xué)術(shù)年會暨省級繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2007年

4 余海;黃常新;王青青;馬文學(xué);曹雪濤;;膜表達(dá)熱休克蛋白和膜型超抗原突變體雙重修飾瘤苗的抗腫瘤作用的研究[A];第八屆全國腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

5 江然;孟芳琳;楊娟玲;王珉;戴平;戴雨希;歷光炎;沈玫;熊超;沙允文;梅澤如;蔣泳;周寶琴;陸寶成;曾志毅;張仁希;熊偉;陳環(huán)球;楊爾欣;趙祥生;唐金海;俞喬;張園;汪儀俊;穆懷德;馬永泉;;我們?yōu)槟[瘤病人制備并應(yīng)用自體瘤苗工作的報(bào)道[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

6 郭玫;吳迪;李淼;吳松彥;張融;趙楓姝;竇駿,;;結(jié)直腸癌干細(xì)胞瘤苗抗腫瘤效應(yīng)及其機(jī)制研究[A];第十一屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會分會場交流報(bào)告集[C];2016年

7 徐立春;卜平;陳平;周娟;劉志敏;孫振華;邊可君;;莪術(shù)醇復(fù)合瘤苗治療胃癌的初步實(shí)驗(yàn)探討[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第五屆基礎(chǔ)理論研究專業(yè)委員會學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

8 夏大靜;鄭樹;章衛(wèi)平;王青青;潘建平;朱敏;張立煌;曹雪濤;;白介素-18基因修飾增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞瘤苗的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究[A];中國免疫學(xué)會第四屆學(xué)術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

9 孫佳楠;蔡凱;王小英;倪瑤瑤;王雅倩;吳松彥;竇駿;;B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21腫瘤干細(xì)胞疫苗的制備及其抗腫瘤效應(yīng)的研究[A];第九屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2014年

10 孫立榮;李曉玲;孫妍;;卡介苗HSP70基因轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞瘤苗制備及抗瘤機(jī)制的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前8條

1 仇逸 胡德榮;我國成功制備胃癌“瘤苗”[N];人民政協(xié)報(bào);2002年

2 楊超倫;“太空瘤苗”研制邁出可喜一步[N];新華每日電訊;2003年

3 ;匯中外免疫專家擬突破腫瘤良策[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

4 通訊員 胡德榮 記者 張?zhí)N;“瘤苗”治療肝胃癌[N];解放日報(bào);2001年

5 解放軍第309醫(yī)院教授 牛旗　整理 李杰;DC瘤苗推動腫瘤免疫治療[N];健康報(bào);2010年

6 不賴摘;腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)可防[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2001年

7 方彤;樹突狀細(xì)胞瘤苗新進(jìn)展[N];健康報(bào);2006年

8 記者白劍峰;腫瘤細(xì)胞太空“旅行”[N];人民日報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黃常新;膜表達(dá)熱休克蛋白和膜型超抗原突變體雙重修飾瘤苗的抗腫瘤作用的研究[D];浙江大學(xué);2004年

2 朱新梅;樹突狀細(xì)胞瘤苗治療大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

3 張浩;淋巴細(xì)胞趨化因子基因修飾的小鼠肝癌樹突狀細(xì)胞融合瘤苗抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[D];浙江大學(xué);2005年

4 王東海;DC/C6融合瘤苗防治大鼠C6膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2005年

5 姜宏景;GM-CSF基因修飾同種異體肺癌細(xì)胞系制備瘤苗治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

6 牛桂蓮;用IL-2轉(zhuǎn)基因B_（16）黑色素瘤瘤苗與特異性CTL細(xì)胞進(jìn)行小鼠腫瘤免疫治療的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1995年

7 張紅梅;樹突狀細(xì)胞—肝癌細(xì)胞株HepG2融合瘤苗及其來源的Exosome抗肝癌免疫活性的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

8 匡志鵬;AFP基因修飾樹突狀細(xì)胞瘤苗的構(gòu)建及對原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展阻斷的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

9 馬征;全細(xì)胞瘤苗誘發(fā)動物保護(hù)性免疫機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

10 李寧;阻斷共抑制信號途徑聯(lián)合趨化抗原基因修飾瘤苗治療腫瘤的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 俞曉毓;卵巢癌ID8癌干樣細(xì)胞分離鑒定及其疫苗效應(yīng)研究[D];東南大學(xué);2018年

2 劉娜;全細(xì)胞瘤苗誘發(fā)動物保護(hù)性免疫機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

3 姚偉榮;宮頸癌U_（14）細(xì)胞正丁醇提取物脂質(zhì)體瘤苗的制備及其抑瘤效應(yīng)觀察[D];江西醫(yī)學(xué)院;2003年

4 楊f

本文編號：2643241