發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 23:36

【摘要】：目的:放射治療是宮頸癌治療的重要手段之一,宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療不敏感被認(rèn)為是放療失敗的主要原因,其具體分子機(jī)制尚未完全明晰。GDF15(生長(zhǎng)分化因子15),屬于TGF-β超家族中的一員,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,但其與宮頸癌放射敏感性相關(guān)的研究甚少。本研究擬通過(guò)探討GDF15對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性和EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)的影響,及其可能的作用機(jī)制,為改善宮頸癌患者的療效提供新的靶點(diǎn)。方法:1、應(yīng)用Western blot檢測(cè)照射前后宮頸癌細(xì)胞株(Siha、Hela、Caski和C33a)中GDF15表達(dá)的變化。2、予以rh GDF15(重組人GDF15蛋白)刺激及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒兩種方式構(gòu)建GDF15高表達(dá)模型,檢測(cè)上調(diào)宮頸癌細(xì)胞GDF15的表達(dá)對(duì)其放射敏感性的影響。3、構(gòu)建特異性針對(duì)GDF15基因的小干擾RNA慢病毒載體,建立GDF15低表達(dá)模型,檢測(cè)下調(diào)宮頸癌細(xì)胞GDF15的表達(dá)對(duì)其放射敏感性的影響。4、應(yīng)用Western blot、Real-time PCR和免疫熒光等方法檢測(cè)不同GDF15表達(dá)模型中β-catenin、c-Myc的表達(dá),探討GDF15調(diào)控宮頸癌放射敏感性可能存在的機(jī)制。5、利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室和Matrigel基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)等方法,檢測(cè)不同GDF15表達(dá)水平對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1、6Gy X-ray照射24h后,不同宮頸癌細(xì)胞株(Siha、Hela、Caski和C33a)中GDF15的表達(dá)均明顯升高。2、予以rh GDF15(100ng/ml)刺激和轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-GDF15質(zhì)粒均可上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中GDF15的表達(dá),與對(duì)照組相比,GDF15高表達(dá)可使宮頸癌細(xì)胞照射后的克隆形成率明顯增加。3、與親代相比,下調(diào)GDF15的表達(dá)可使宮頸癌細(xì)胞照射后的克隆形成率明顯降低、凋亡率明顯增加。4、GDF15可上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中β-catenin、c-Myc及磷酸化c-Myc的表達(dá),而使用β-catenin抑制劑(XAV-939)和c-Myc抑制劑(10058-F4)后,可逆轉(zhuǎn)高表達(dá)GDF15宮頸癌細(xì)胞株的放射抵抗。5、與親代相比,GDF15-si RNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱,且細(xì)胞內(nèi)MMP9、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)降低,E-cadherin的表達(dá)增加。再次給予rh GDF15刺激后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng),且細(xì)胞內(nèi)MMP9、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)增加,E-cadherin的表達(dá)降低。結(jié)論:1、GDF15是影響宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的重要調(diào)控因子;2、GDF15可通過(guò)β-catenin/c-Myc通路增加宮頸癌細(xì)胞的放射耐受;3、GDF15參與宮頸癌細(xì)胞EMT表型的調(diào)控。綜上所述,提示GDF15可能為逆轉(zhuǎn)宮頸癌放射抵抗提供新的治療策略。
【圖文】：

頸癌細(xì)胞的放射敏感性，首先我們構(gòu)建GDF15高表達(dá)模型，檢測(cè)上調(diào)GDF15對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響。Western Blot結(jié)果顯示，，予以rhGDF15（100ng/ml）刺激后，和對(duì)照組相比，宮頸癌細(xì)胞中GDF15的表達(dá)明顯升高（如圖2A所示）。構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-GDF15，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-GDF15轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞Siha和Hela，Western Blot結(jié)果表明GDF15高表達(dá)模型構(gòu)建成功（如圖2B所示）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未給予rhGDF15相比，在培養(yǎng)基中添加rhGDF15（100ng/ml）后，輻射后細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯增加，生存曲線顯示在不同照射劑量下細(xì)胞存活明顯增加（如圖2C和2D所示）。與轉(zhuǎn)染空白載體相比，pEGFP-N1-GDF15轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞Siha和Hela均呈現(xiàn)出明顯的放射抵抗（如圖2E所示）。上述結(jié)果表明，GDF15高表達(dá)狀態(tài)下（予以rhGDF15刺激或pEGFP-N1-GDF15轉(zhuǎn)染）

顯下降（如圖 3B 所示）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GDF15低表達(dá)時(shí)，宮頸癌細(xì)胞輻射后細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯下降（如圖3C所示）。細(xì)胞生存曲線提示，在GDF15表達(dá)下調(diào)后，宮頸癌細(xì)胞在不同照射劑量下細(xì)胞存活明顯降低（如圖3D所示）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)，轉(zhuǎn)染GDF15-siRNA的Siha和Hela細(xì)胞在輻射后48小時(shí)的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GDF15-siRNA的Siha和Hela細(xì)胞輻射后細(xì)胞凋亡率（早凋和晚凋的細(xì)胞比例）分別為（17.32±1.01）%、（23.56±1.42）%，和陰性對(duì)照組（4.08±0.72）%、（4.23±0.84）% 相比均明顯增加，進(jìn)一步提示GDF15表達(dá)下調(diào)后，Siha細(xì)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2640823