本文關鍵詞：CD147-Sp1關系環(huán)對卵巢癌細胞侵襲性影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位于宮頸癌與子宮內(nèi)膜癌之后,排名第三[1-3],其中上皮性腫瘤占原發(fā)性卵巢腫瘤的50%~70%,而惡性類型占卵巢癌的85%~90%[4]。多數(shù)卵巢癌病人由于早期缺乏明顯的臨床癥狀和高效的篩查技術,在發(fā)現(xiàn)時已為時已晚,并且期別也很高,也就促成了卵巢癌的治療難度大、復發(fā)率高,5年生存率非常低的嚴峻形勢[5]。CD147,又名EMMPRIN或Basigin,是一個高度糖基化的跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員[6-9]。CD147通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分泌降解細胞外基質(zhì)或通過上調(diào)VEGF表達、抑制凋亡等多種途徑促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[10-12]。CD147的高表達與卵巢癌的不良預后息息相關[13],作為一種重要的腫瘤標志物,闡明其表達調(diào)控機制對卵巢癌的診斷及治療具有重要意義。孔等[14]的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1能直接與CD147啟動子區(qū)特異結合并能有效啟動其轉(zhuǎn)錄表達。此外,他們還發(fā)現(xiàn)CD147的低甲基化可以增加其與Sp1蛋白的親和力,從而上調(diào)CD147表達。研究報道提示Sp1蛋白的磷酸化形式對于Sp1介導的基因轉(zhuǎn)錄激活作用具有重要意義[15]。Sp1的磷酸化形式或可增加其與DNA的結合能力,或可增加其蛋白的穩(wěn)定性,或可影響它的轉(zhuǎn)錄活性。Tan等發(fā)現(xiàn)管緊張素Ⅱ激活PKC通路使Sp1的鋅指結構域(Thr668,Ser670和Thr681位點)磷酸化,磷酸化后的Sp1與血小板衍生因子-D啟動子的結合能力增加[16]。阻斷JNK信號通路導致的Sp1在Thr278和Thr739位點的磷酸化,可以導致sp1的蘇木素化,加速降解[17,18]。由于sp1的轉(zhuǎn)錄活性受到其與啟動子的結合能力,蛋白的合成,核酸轉(zhuǎn)運能力,與其它蛋白的相互作用以及蛋白的穩(wěn)定性等多種因素影響,很難判斷sp1的磷酸化對cd147轉(zhuǎn)錄活性的影響。本課題的研究目標有四點:首先明確sp1磷酸化是否參與cd147基因調(diào)控,其次探討其具體調(diào)控機制[19],再次分析sp1磷酸化與cd147基因的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響,最后分別在卵巢癌細胞及組織中分析sp1磷酸化與cd147表達的相關性[20]。第一部分:明確sp1磷酸化參與cd147基因表達調(diào)控。我們運用基因定點突變的方法構建了6個sp1磷酸化位點的突變體(thr355,thr453,th668,ser670,thr681,thr739)[21,22],將特定位點的絲?蘇氨酸突變成谷氨酸,使其失去被磷酸化激活的功能。之后通過瞬時轉(zhuǎn)染突變體和cd147啟動子檢測螢火蟲熒光素酶強度發(fā)現(xiàn)sp1在thr453和thr739兩個位點的突變可以顯著降低sp1對cd147基因表達上調(diào)的作用[23]。在隨后的實時定量pcr和westernblot的實驗中也得到了驗證。第二部分:探討sp1磷酸化調(diào)控cd147基因表達機制。為了探討sp1磷酸化參與cd147基因表達調(diào)控的具體機制,我們運用pi3k/akt和mapk/erk磷酸化通路特定抑制劑ly294002、雷帕霉素和pd98059預處理卵巢癌細胞后發(fā)現(xiàn)[24],sp1在thr453和thr739兩個位點的磷酸化水平會隨之下降,而總蛋白未見明顯變化。此外,我們還發(fā)現(xiàn)cd147的蛋白水平也隨之下降,提示通過pi3k/akt/mtor和mapk/erk途徑可以激活sp1的磷酸化,而當sp1磷酸化水平受抑制時,cd147的表達水平也下降,提示sp1磷酸化對sp1激活cd147基因轉(zhuǎn)錄具有激活作用。而當我們上調(diào)或下調(diào)cd147的表達后,發(fā)現(xiàn)pakt,p70s6k和perk以及sp1在thr453和thr739兩個位點的磷酸化水平均下降,而總蛋白均未見明顯變化。綜合第一部分實驗,我們得知sp1在thr453和thr739位點的磷酸化可以增強sp1對cd147基因的轉(zhuǎn)錄激活作用,而在skov3細胞中過表達cd147基因后,sp1在thr453和thr739位點的磷酸化表達增加[25]。這是由于上游的pi3k/akt/mtor和mapk/erk通路被活化造成的。cd147-sp1關系環(huán)構成的正反饋環(huán)路可能成為解釋cd147差異性表達的原因之一。第三部分:檢測sp1磷酸化與cd147基因表達的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響。用sp1(在thr453和thr739位點)磷酸化抗體和cd147單抗單獨或聯(lián)合封閉卵巢癌HO-8910細胞系的高轉(zhuǎn)移株,Transwell實驗發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞的侵襲性降低,提示Sp1-CD147關系環(huán)可以增加卵巢癌的侵襲性。第四部分:檢測Sp1磷酸化與CD147基因在卵巢癌細胞及組織中的表達并分析其相關性。我們運用Western blot方法檢測卵巢癌細胞株SKOV3、HO-8910和HO-8910PM中p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表達。結果顯示在卵巢癌細胞中Sp1磷酸化蛋白水平和CD147蛋白在三種細胞系中的表達高低具有一致性。之后我們運用免疫組化的方法檢測了53例卵巢癌標本中的p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表達和分布。結果顯示Sp1的磷酸化蛋白主要表達于卵巢癌的細胞核膜和核內(nèi),而CD147主要表達于細胞膜和細胞漿中。CD147的表達情況統(tǒng)計結果示12例(強陽性,22.64%);15例(陽性,28.30%);6例(弱陽性,11.32%);20例(陰性,37.74%)Phospho-Sp1(T453)的表達情況統(tǒng)計結果示24例(強陽性,45.28%);13例(陽性,24.53%);7例(弱陽性,13.21%);9例(陰性,16.98%)而phospho-Sp1(T739)的表達情況統(tǒng)計結果示16例(強陽性,30.19%),14例(陽性,26.42%),10例(弱陽性,18.87%);13例(陰性,24.53%)。CD147陽性結果所占比例為62.26%,而phospho-Sp1(T453)和phospho-Sp1(T739)的陽性表達率分別為83.02%,75.47%。Spearman秩相關分析顯示p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表達低度相關(rT453=0.477,P0.01;rT739=0.461,P0.01)。根據(jù)上述結果,我們明確了轉(zhuǎn)錄因子Sp1的磷酸化修飾與CD147基因表達的相互作用,并且發(fā)現(xiàn)Sp1-CD147正反饋關系環(huán)能促進卵巢癌細胞的侵襲性。這些結果有助于我們進一步了解卵巢癌中CD147基因高表達的發(fā)生機制,提示通過破壞Sp1-CD147正反饋關系環(huán)有助于卵巢癌的治療。
【關鍵詞】：卵巢癌 Sp1磷酸化 CD147 正反饋
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-20
• 實驗一 Sp1磷酸化參與CD147基因表達調(diào)控20-40
• 1 材料20-22
• 1.1 主要儀器20-21
• 1.2 細胞系和細胞株21
• 1.3 質(zhì)粒21
• 1.4 主要試劑21-22
• 1.5 主要緩沖液22
• 2 方法22-32
• 2.1 細胞培養(yǎng)22
• 2.2 實驗所需載體的擴增及保存22-24
• 2.3 構建Sp1磷酸化位點突變體24-26
• 2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗檢測Sp1磷酸化對CD147的調(diào)控作用26-27
• 2.5 RT-PCR檢測Sp1磷酸化對CD147表達水平的影響27-30
• 2.6 Western blot檢測Sp1磷酸化對CD147表達水平的影響[98]30-32
• 2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析32
• 3 結果32-38
• 3.1 構建Sp1磷酸化位點突變體32
• 3.2 促進CD147表達的Sp1磷酸化位點的確定32-38
• 4 討論38-40
• 實驗二 CD147通過激活MAPK/ERK/mTOR和PI3K/AKT磷酸化通路促進Sp1磷酸化40-50
• 1 材料40-41
• 1.1 主要儀器40
• 1.2 細胞系和細胞株40
• 1.3 主要試劑40-41
• 1.4 主要緩沖液41
• 2 方法41-43
• 2.1 Western blot檢測磷酸化通路抑制劑阻滯后Sp1磷酸化和CD147表達41-42
• 2.2 瞬時轉(zhuǎn)染42
• 2.3 CD147干涉42
• 2.4 Western blot檢測CD147對Sp1磷酸化表達的影響[98]42
• 2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析42-43
• 3 結果43-48
• 3.1 MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR磷酸化通路抑制劑下調(diào)Sp1磷酸化和CD147的蛋白表達43
• 3.2 上調(diào)CD147促進Sp1磷酸化表達43
• 3.3 干擾CD147抑制Sp1磷酸化表達43-44
• 3.4 CD147-Sp1關系環(huán)44-48
• 4 討論48-50
• 實驗三 CD147-Sp1關系環(huán)對卵巢癌細胞侵襲性的影響50-54
• 1 材料50
• 1.1 主要儀器50
• 1.2 細胞系和細胞株50
• 1.3 主要試劑50
• 2 方法50-51
• 2.1 Transwell實驗檢測CD147-Sp1關系環(huán)對卵巢癌細胞侵襲性的影響[13]50-51
• 2.2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析[13]51
• 3 結果51-53
• 3.1 CD147抗體封閉顯著降低HO-8910PM的侵襲能力51-52
• 3.2 Sp1磷酸化抗體封閉顯著降低HO-8910PM的侵襲能力52
• 3.3 CD147和Sp1磷酸化抗體聯(lián)合封閉顯著降低HO-8910PM的侵襲能力52-53
• 4 討論53-54
• 實驗四 CD147與Sp1磷酸化在卵巢癌中的表達相關性54-62
• 1 材料54-56
• 1.1 主要儀器54
• 1.2 細胞系和細胞株54
• 1.3 病理標本54-55
• 1.4 主要試劑55
• 1.5 主要緩沖液55-56
• 2 方法56-57
• 2.1 細胞培養(yǎng)56
• 2.2 Western blot檢測卵巢癌細胞Sp1磷酸化和CD147蛋白表達56
• 2.3 免疫組化檢測CD147與Sp1磷酸化在卵巢癌組織中的表達56-57
• 2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析57
• 3 結果57-61
• 3.1 CD147與Sp1磷酸化在卵巢癌細胞系中的表達正相關57
• 3.2 CD147與Sp1磷酸化在卵巢癌組織中的表達具有相關性57-61
• 4 討論61-62
• 小結62-63
• 參考文獻63-75
• 個人簡歷和研究成果75-77
• 致謝77-78

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