【摘要】：目的:沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regular1,SIRT1)系sirtuin家族成員之一,是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的III類組蛋白去乙酰化酶,可參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝以及應(yīng)激反應(yīng)等生命過程。研究證實(shí)SIRT1在多種腫瘤中異常表達(dá)且與腫瘤耐藥有關(guān)。本研究應(yīng)用靶向SIRT1的RNA干擾慢病毒重組載體分別在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平研究SIRT1-shRNA對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞移植瘤生長的影響,進(jìn)一步探討沉默SIRT1對(duì)宮頸癌順鉑敏感性的影響及其與耐藥相關(guān)蛋白之間的關(guān)系。方法:分別構(gòu)建三個(gè)攜帶不同SIRT1靶點(diǎn)的RNA干擾慢病毒重組載體,感染人宮頸癌Hela細(xì)胞,篩選出抑制率最高的RNA干擾慢病毒重組載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞水平試驗(yàn)分為6組:空白Hela細(xì)胞對(duì)照組、慢病毒陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑polybrene組、SIRT1-shRNA組、順鉑組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組,CCK-8法測(cè)定Hela細(xì)胞的增殖抑制率。動(dòng)物試驗(yàn)采用3~4周齡雌性裸鼠,分為5組:空白Hela細(xì)胞組、慢病毒陰性對(duì)照組、SIRT1-shRNA組、順鉑組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組。分別于右側(cè)腋部皮下注射6×10~6個(gè)空白Hela細(xì)胞懸液、陰性慢病毒感染的Hela細(xì)胞懸液及SIRT1-shRNA感染的Hela細(xì)胞懸液。造模成功后,待移植瘤瘤體長度達(dá)7cm,順鉑組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組裸鼠腹腔注射順鉑(2mg/kg,200μl),每周兩次,共計(jì)三周。每3d測(cè)量一次裸鼠重量以及瘤體體積,繪制裸鼠腫瘤的生長曲線。順鉑治療結(jié)束后3d,處死裸鼠、稱重,剝離裸鼠皮下腫瘤組織并測(cè)量和稱重。HE染色觀察裸鼠腫瘤組織的病理學(xué)變化;免疫組織化學(xué)染色法觀察SIRT1在裸鼠腫瘤組織內(nèi)的表達(dá);Western blot檢測(cè)SIRT1以及耐藥相關(guān)蛋白PARP1、DNA-PKcs和ABCC1的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,SIRT1-shRNA-2號(hào)慢病毒載體在MOI=20,polybrene=6μg/ml完全培養(yǎng)基的條件下,細(xì)胞感染率90%,存活率95%,為慢病毒的最佳感染條件。CCK-8結(jié)果顯示:與空白Hela細(xì)胞對(duì)照組相比,polybrene組和慢病毒陰性對(duì)照組細(xì)胞抑制率分別為5.7%和11.2%,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而SIRT1-shRNA組與順鉑組細(xì)胞抑制率分別為65.2%和21.6%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明各組裸鼠移植瘤成瘤率為100%,裸鼠移植瘤曲線結(jié)果顯示:與空白Hela細(xì)胞組瘤體相比,慢病毒陰性對(duì)照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而SIRT1-shRNA與順鉑組瘤體體積均明顯縮小(P0.05),SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組裸鼠瘤體的抑制作用最為明顯(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示:在SIRT1-shRNA組、順鉑組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組中移植瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,表現(xiàn)為核固縮、碎裂,腫瘤細(xì)胞體積縮小以及出現(xiàn)壞死和凋亡等。免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示:在SIRT1-shRNA組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組中,SIRT1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。Western Blot結(jié)果表明:與空白Hela細(xì)胞對(duì)照組相比,SIRT1-shRNA組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組SIRT1與ABCC1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05),而SIRT1-shRNA組、順鉑組和SIRT1-shRNA聯(lián)合順鉑組PARP1與DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)靶向SIRT1的shRNA可以顯著抑制Hela細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)及Hela細(xì)胞的增殖。在裸鼠體內(nèi),SIRT1通過上調(diào)與宮頸癌耐藥相關(guān)蛋白PARP1、DNA-PKcs的表達(dá),并下調(diào)ABCC1蛋白的表達(dá)影響宮頸癌Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。
【圖文】：

結(jié)果結(jié) 果A 慢病毒感染 Hela 細(xì)胞條件的優(yōu)化的靶向 SIRT1 的 shRNA 慢病毒載體，將攜帶不同 S體及 shRNA 陰性對(duì)照慢病毒載體分別感染 Hela 細(xì)胞 Hela 細(xì)胞對(duì)照組相比，慢病毒陰性對(duì)照組 SIRT1 蛋白，而三組SIRT1-shRNA干擾組SIRT1蛋白表達(dá)水平均明T1-shRNA（25072-1, GGCTTGATGGTAATCAGTA）感列慢病毒，，慢病毒感染條件采用本實(shí)驗(yàn)室前期研究l 的完全培養(yǎng)基（圖 1）。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文IRT1-shRNA 聯(lián)合順鉑對(duì) Hela 細(xì)胞增殖的影響將 SIRT1-shRNA 與 3μM DDP 聯(lián)合作用于 Hela 細(xì)胞，CCK-8 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，SIRT1-shRNA 組與 DDP 組 Hela 細(xì)胞的增殖率明顯降低（P<0.0 SIRT1-shRNA 聯(lián)合 DDP 組 48h 抑制率高達(dá) 84.3%，而轉(zhuǎn)染試劑 polybrene 組、性對(duì)照組和空白 Hela 細(xì)胞對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2，P>0.05）
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2638713