【摘要】：背景與目的線粒體是細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞器,參與細(xì)胞能量產(chǎn)生、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、鈣離子內(nèi)環(huán)境平衡、細(xì)胞凋亡等各種關(guān)鍵性的細(xì)胞活動(dòng),在卵母細(xì)胞的成熟、受精以及早期胚胎的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,可從親代到子代穩(wěn)定遺傳。卵母細(xì)胞和精子中均含有一定數(shù)量的線粒體DNA。卵母細(xì)胞與精子相遇并受精,很短的一段時(shí)間后精子中的線粒體即被降解。因此,胚胎中的線粒體及線粒體DNA幾乎全部來(lái)自于卵母細(xì)胞。研究表明非整倍體胚胎的線粒體DNA水平比整倍體高,且線粒體DNA拷貝數(shù)與母體生育年齡和胚胎非整倍性均相關(guān)聯(lián),線粒體DNA拷貝數(shù)可作為臨床上預(yù)測(cè)植入前囊胚染色體是否異常的標(biāo)志。目前已經(jīng)提出,在胚胎發(fā)育的最初階段會(huì)出現(xiàn)線粒體增殖,來(lái)適應(yīng)胚胎發(fā)育的起始和代謝的變化。因此,異常或種植潛力較差胚胎的線粒體DNA水平增加或提前復(fù)制增殖可能是一個(gè)識(shí)別胚胎應(yīng)激和發(fā)育異常的標(biāo)志,這種現(xiàn)象是線粒體應(yīng)對(duì)不良外界環(huán)境做出的代償性反應(yīng)。但是,有研究組運(yùn)用線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量方法后,發(fā)現(xiàn)線粒體DNA與年齡、倍性及植入潛能并無(wú)較深入的關(guān)系,其預(yù)測(cè)價(jià)值有所降低。本實(shí)驗(yàn)的目的在于,研究染色體倍性及胚胎質(zhì)量與胚胎線粒體DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系,以探究染色體倍性異常的囊胚線粒體DNA是否有提前復(fù)制增殖的現(xiàn)象,評(píng)估線粒體DNA拷貝數(shù)可否作為判斷囊胚質(zhì)量的指標(biāo)。材料和方法分別用孤雌激活技術(shù)構(gòu)建單倍體胚胎、顯微胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)構(gòu)建三倍體胚胎、細(xì)胞融合技術(shù)制作四倍體胚胎,同時(shí)運(yùn)用相應(yīng)技術(shù)構(gòu)建二倍體胚胎作為對(duì)照組;藥物(STZ)誘導(dǎo)法構(gòu)建糖尿病小鼠模型、體外延時(shí)培養(yǎng)以獲得老化卵子,正常健康小鼠來(lái)源的卵子為對(duì)照組,與相同來(lái)源及密度的精子混合進(jìn)行體外受精與胚胎培養(yǎng)。對(duì)上述各模型所得囊胚應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Real Time qPCR)中絕對(duì)定量PCR的方法檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù)。每組數(shù)據(jù)均重復(fù)三次以上。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以x±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示,采用卡方檢驗(yàn);P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1對(duì)孤雌激活(單倍體組)、ICSI操作(三倍體組)及受精(四倍體組)后96 h及120 h形成的囊胚收樣,簡(jiǎn)稱96 h囊胚和120 h囊胚。兩種非二倍體囊胚線粒體DNA拷貝數(shù)與分別相應(yīng)二倍體囊胚對(duì)照組相比并無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(96h囊胚:單倍體:P=0.4291,三倍體:P=0.6001,四倍體:P=0.5325;120 h囊胚:單倍體:P=0.3005,三倍體:P=0.6073,四倍體:P=0.9767)。2無(wú)論是單倍體、二倍體、三倍體還是四倍體,96 h囊胚與120 h囊胚線粒體DNA拷貝數(shù)均無(wú)明顯差異(單倍體:P=0.7791;三倍體:P=0.8456;四倍體:P=0.7113)。3大部分單倍體、三倍體的發(fā)育速度均比對(duì)照組二倍體發(fā)育速度慢。4隨著染色體倍性的增加,同時(shí)期囊胚的細(xì)胞數(shù)逐漸減少(單倍體∶二倍體=60.09±2.61∶48.88±2.37;三倍體∶二倍體=29.00±2.46∶42.43±3.04;四倍體∶二倍體=21.77±1.52∶44.46±1.90),而且細(xì)胞體積逐漸增大。5對(duì)于質(zhì)量較差的糖尿病小鼠囊胚,其線粒體DNA拷貝數(shù)是明顯增加的,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0062)。體外老化卵子來(lái)源的囊胚,其線粒體DNA數(shù)量也顯著高于正常(P=0.0092)。結(jié)論1線粒體DNA拷貝數(shù)與胚胎染色體倍性無(wú)必然聯(lián)系。2質(zhì)量較差的胚胎線粒體DNA拷貝數(shù)升高,因此線粒體DNA拷貝數(shù)可能作為判斷胚胎質(zhì)量的參考指標(biāo)。
【圖文】：

所得不同倍性的囊胚中隨機(jī)選取部分進(jìn)行了染色體鋪片和染色。經(jīng)過(guò)秋水仙素同步化的囊胚細(xì)胞（包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞）大多處于有絲分裂中期，因此染色體可以以較明顯的形態(tài)展現(xiàn)。如圖1.1所示，分別顯示了單倍體（圖1.1A）、二倍體（圖 1.1 B）、三倍體（圖 1.1 C）和四倍體（圖 1.1 D）囊胚中一個(gè)細(xì)胞所有染色體的狀態(tài)。經(jīng)鑒定，，染色體條數(shù)均符合。圖 1.1 囊胚倍性的鑒定。（A）單倍體；（B）二倍體；（C）三倍體；（D）四倍體。

圖 1.2 囊胚發(fā)育速度與染色體倍性關(guān)系A(chǔ) 拷貝數(shù)與囊胚染色體倍性的關(guān)系激活單倍體及二倍體囊胚、卵胞漿內(nèi)精子注射三倍體及二胎電融合所成四倍體囊胚及其相應(yīng)對(duì)照組二倍體胚胎，分別
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2624133