【摘要】：研究背景及目的:高齡女性的生育問題是目前所面臨的重大社會需求,隨著女性年齡增加其生育能力逐漸下降,輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠結(jié)局變差,其原因主要在于卵泡數(shù)量減少或卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。鑒于顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs)與卵母細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)及功能上密切關(guān)聯(lián),同時,線粒體,做為細(xì)胞供能及代謝調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)對確保GCs的正常功能狀態(tài)有著重要意義。因此,本研究通過建立穩(wěn)定的人卵巢壁層顆粒細(xì)胞(mural granulosa cells,mGCs)分離、培養(yǎng)體系,研究mGCs線粒體的年齡相關(guān)性改變,進(jìn)一步探索高齡相關(guān)的GCs線粒體功能減退過程中的調(diào)控機制,為改善高齡女性GCs線粒體功能尋找新的研究靶點。方法:1.采用密度梯度離心法從輔助生殖過程中獲取的廢棄卵泡液中分離mGCs,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度,透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),并采用免疫組化染色、免疫熒光染色鑒定 mGCs 促卵泡生成素受體(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的特異性表達(dá),CCK-8法檢測mGCs細(xì)胞的增殖活性。2.采用TEM對比分析高齡組(≥38歲)與對照組(38歲)患者mGCs線粒體的超微結(jié)構(gòu),實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)檢測線粒體 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷貝數(shù)、4977-bp大片段缺失比例、ATP5A1、ATP5I及3-羥基異丁酸脫氫酶(3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase,HIBADH)mRNA 的表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ATP 水平,Western blot 檢測氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)復(fù)合體蛋白的表達(dá)。3.采用 Western blot 檢測高齡組與對照組患者mGCs中HIBADH蛋白表達(dá),在人卵巢顆粒細(xì)胞系(KGN細(xì)胞)中,采用Western blot分別檢測沉默、過表達(dá)HIBADH基因后OXPHOS復(fù)合體蛋白、HIBADH蛋白的表達(dá),利用多功能酶標(biāo)儀檢測處理后KGN細(xì)胞中ROS、ATP、MMP水平。結(jié)果:1.體外分離所得mGCs細(xì)胞存活率90%,白細(xì)胞污染率6.73%,FSHR陽性表達(dá)率99%,并于體外培養(yǎng)第3天達(dá)到增殖高峰。2.對照組(38歲)mGCs線粒體多呈圓形或橢圓形,含管狀或囊狀嵴,基質(zhì)密度均一,高齡組多見細(xì)長形線粒體,富含嵴結(jié)構(gòu)及高密度基質(zhì)顆粒,且異常線粒體顯著增多;mtDNA拷貝數(shù)與年齡呈正相關(guān),未檢出4977-bp片段缺失mtDNA;高齡組mGCs MMP、ATP水平較對照組顯著降低,ROS在兩組間未見統(tǒng)計學(xué)差異;ATP5A1蛋白、mRNA及HIBADH mRNA表達(dá)水平隨年齡增加而降低且HIBADH mRNA表達(dá)水平與ATP51A及ATP5I mRNA表達(dá)水平呈正向直線相關(guān)。3.HIBADH蛋白表達(dá)在mGCs中隨著年齡的增加而降低,在KGN細(xì)胞中,細(xì)胞增殖活性、ATP含量及OXPHOS復(fù)合體蛋白Ⅳ-MTCO1、V-ATP5A1蛋白表達(dá)水平隨著HIBADH基因的過表達(dá)而增加,隨HIBADH基因沉默而降低。結(jié)論:1.建立并優(yōu)化了人卵巢mGCs分離、體外培養(yǎng)及鑒定體系。2.mGCs線粒體功能隨年齡增加減退,其中氧化磷酸化功能減退是主要表現(xiàn)。3.HIBADH基因在調(diào)控人卵巢GCs線粒體氧化磷酸化功能的過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

２．４．１．２人卵巢ｍＧＣｓ計數(shù)及存活率檢測逡逑（１）吸取上述單細(xì)胞懸液１０邐采用細(xì)胞計數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，細(xì)胞逡逑密度（個／ｍＬ）＝（細(xì)胞計數(shù)板四角４個大方格細(xì)胞總數(shù)／４）邋ｘｌ0４。計數(shù)板如圖１－１所逡逑／」、？邋０逡逑Ｉ邋Ｏｍｍ邋ｔ邋＾邋１邋ｕ邋ｍｍ逡逑ｊｊｊ邋r>邋Ｔｉｊ邋｜｜｜邋ｊｊｙ逡逑Ｂｉ＾邐Ｈ邋棚邋ＩＩＫ￥逡逑｜邐二４二ｆ＿率—：率ｇ邐二ｋ逡逑邐ａ邐■■—Ｉ邐：二封邐二去逡逑邐邐邋－－－－０邋２邋ｍｍ邋Ｊ逡逑１邋ｉ邋ｆ邋１１邋ｊｉｉｆ邋Ｈｉ邋ｉｊｊ邋１邋｜邋｜逡逑［邋ｕ邋ｕ邋0＂ｘ）邋Ｉ邋，邋，ｉ邐＿＿ｕ－．�。浚剩咤澹海澹海�；邋ｌ！ｉ邋Ｉ邋－邋￣逡逑１邐１邐ｒ＾Ｖ邋ｉ邐１邋ｖＴ逡逑0：＞邋ｍｍ＊邋１邋ｊ邋Ｉ邋｛邋［＇＂Ｉ邋Ｉ邋；邋Ｉ邋Ｔ￣逡逑圖１－１．細(xì)胞計數(shù)板示意圖逡逑（２）單細(xì)胞懸液與０．４％臺盼藍(lán)染液以９：１混合混勻后，在３邋ｍｉｎ內(nèi)計數(shù)細(xì)胞存逡逑活率，光鏡下，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，活細(xì)胞呈無色透明狀。細(xì)胞存活率＝活細(xì)逡逑胞數(shù)／邋（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）。逡逑２．４．１．３人卵巢ｍＧＣｓ的原代培養(yǎng)逡逑依據(jù)實驗需要，使用ＤＭＥＭ／Ｆ１２（含１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和１００邋ｎｇ／ｍＬ逡逑鏈霉素）的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)單細(xì)胞懸液的密度并培養(yǎng)細(xì)胞，，將其接種在細(xì)胞培養(yǎng)板或逡逑已放置細(xì)胞爬片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于３７°Ｃ邋５％Ｃ０２細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每２４ｈ于逡逑倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的體外生長情況

圖１－２．人卵巢ｍＧＣｓ第１－９天體外生長情況０２００）邐．逡逑注：在培養(yǎng)第１天后細(xì)胞貼壁，細(xì)胞多呈梭形、星形等不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞與細(xì)胞間通過偽足相連接，高倍鏡下觀察細(xì)胞核大，圓形且核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)中顆粒豐富（Ｄ１）。約在培養(yǎng)第３天殖達(dá)到高峰，細(xì)胞聚集成團(tuán)（Ｄ３），隨后至第６天，細(xì)胞偽足張力逐漸減低，呈成纖維細(xì)胞形改變（Ｄ６）。在培養(yǎng)第７天至第９天，培養(yǎng)液中死亡漂浮的細(xì)胞逐漸增多，可見細(xì)胞輪廓逐漸糊，細(xì)胞與細(xì)胞間偽足逐漸消失，高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)中顆粒量逐漸減少，細(xì)胞整體狀態(tài)呈老、退化的現(xiàn)象（Ｄ７－９）。逡逑３．２邋人卵巢ｍＧＣｓ純度、特異性及增殖特性的鑒定逡逑３．２．１流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度逡逑ＣＤ４５廣泛表達(dá)于白細(xì)胞表面，而在人卵巢ｍＧＣｓ中表達(dá)陰性，采用流式細(xì)儀檢測分離所得ｍＧＣｓ邋ＣＤ４５＋細(xì)胞的比例，用來評估本研究分離方法中白細(xì)胞對標(biāo)細(xì)胞的污染率，從而鑒定細(xì)胞純度，共獨立檢測１０份標(biāo)本，ＣＤ４５＋細(xì)胞的比
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R711

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2624196