【摘要】：研究背景宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報告推算,2018年全球女性宮頸癌新發(fā)病例數(shù)為57萬例,死亡病例數(shù)為31.1萬例,發(fā)病病例和死亡比例在女性全身惡性腫瘤中均排在第四位。在中國,每年新增宮頸癌病例約14萬例,死亡病例約3.7萬例。目前公認的導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要危險因素是高危型人類乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的持續(xù)感染。從最初的HPV感染到宮頸癌的發(fā)生需要大約10-20年的時間,這意味著宮頸癌的發(fā)生是一個多因素相關(guān)的復(fù)雜過程。大多數(shù)宮頸癌是由HPV16和HPV18感染導(dǎo)致的。在我國,HPV58是繼HPV16、18之后的導(dǎo)致宮頸癌的第三重要型別,且近年來感染率有升高趨勢。近20年來,宮頸癌的5年生存率沒有變化,所有目前的治療策略(放療、化療、手術(shù))在療效上己經(jīng)趨于平穩(wěn),這些治療策略對正常細胞苛刻,對宮頸惡性組織的靶向性不夠。有效預(yù)防HPV病毒感染的積極措施為接種HPV疫苗,但是當(dāng)前的疫苗既不能預(yù)防所有類型的HPV感染,也不能治療已經(jīng)存在的病變。在研究HPV致病機制的基礎(chǔ)上,如何有效清除HPV感染及控制HPV的致病能力,一直是宮頸癌防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前亟需一種有效的治療HPV感染發(fā)病的方法及一種新型的更有效的宮頸癌治療方式。20世紀80年代末到90年代初,研究人員在細菌和古細菌基因組中觀察到一種脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)序列,被稱為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat squences,CRISPR)。隨著研究的進展,人們認識到CRISPR-CRISPR相關(guān)序列(CRISPR-Associated Squences,Cas)系統(tǒng)是細菌和古細菌中一種獲得性免疫系統(tǒng),通過引導(dǎo)RNA(guide RNA,gRNA)介導(dǎo),Cas酶特異性的切割外源遺傳物質(zhì),用以對抗入侵的病毒和質(zhì)粒�；虻漠惓１磉_導(dǎo)致很多人類疾病的發(fā)生。CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以對高等生物的細胞基因組DNA精準高效的編輯,因此在各種人類疾病的基因治療方面已展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。CRISPR-Cas9系統(tǒng)對于清除生物體內(nèi)的病毒感染是一種非常有效的方法。到目前為止比如乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)與肝癌、EB 病毒(Epstein-Barr virus,EBV)與Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌、人類皰疹病毒與卡波西肉瘤及HPV與宮頸癌等的研究。當(dāng)前,CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)主要應(yīng)用于HPV16、18相關(guān)宮頸癌基因治療的研究,但尚未有應(yīng)用于HPV58相關(guān)宮頸癌治療的報道。本課題擬研究CRISPR-Cas9系統(tǒng)在HPV58陽性宮頸癌細胞及組織中的基因編輯及治療,具體研究內(nèi)容包括以下兩部分:第一部分:CRISPR-Cas9系統(tǒng)在HPV58陽性宮頸癌細胞增殖與凋亡的影響及其機制的實驗研究研究目的:研究CRISPR-Cas9系統(tǒng)在HPV58陽性宮頸癌C33A細胞(C33A/LV-HPV58E6E7)靶向失活E6、E7基因及抑制癌細胞增殖和促進凋亡的分子機制,并驗證CRISPR-Cas9系統(tǒng)是否可被發(fā)展成為抑制HPV58感染及相關(guān)宮頸癌的新一代基因治療技術(shù)。研究方法:1.利用雙gRNA法(成對的gRNA/Cas9 D10A策略),設(shè)計并合成了四對不同的gRNA序列,并將它們分別酶連入載體pAIO-mCherry的相應(yīng)表達框中,從而構(gòu)建出可分別針對HPV58 E6、E7兩個基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的表達質(zhì)粒 pAIO-mCherry/gRNAI、和 pAIO-mCherry/gRNA2、pAIO-mCherry/gRNA3 和pAIO-mCherry/gRNA4,并分別進行Sanger測序驗證。2.使用T7核酸內(nèi)切酶I(T7 EI)酶切試驗,驗證CRISPR-Cas9系統(tǒng)在目標(biāo)基因組上的切割效率。選出具有Cas9切割效率的靶點片段,測序并分析結(jié)果。3.將CRISPR-Cas9系統(tǒng)的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達HPV58型E6E7融合基因的人C33A宮頸癌細胞系(C33A/LV-HPV58E6E7)中。4.分別利用Westem-Blot檢測、CCK-8增殖實驗、AnnexinV-FITC/PI染色及流式細胞術(shù)實驗檢測CRISPR-Cas9系統(tǒng)對C33A/LV-HPV58E6E7細胞系E6、E7、p53、pRb蛋白表達及細胞增殖和凋亡的影響。研究結(jié)果:1.T7核酸內(nèi)切酶I(T7EI)測定CRISPR-Cas9/gRNA切割效率:通過T7核酸內(nèi)切酶I(T7EI)酶切試驗,結(jié)果表明我們構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以成功且高效地對細胞基因靶點片段進行切割和編輯,其中Cas/gRNA1的切割率為 41.5%,Cas/gRNA2 的切割率為 54.6%,Cas/gRNA3 的切割率為 62.4%,Cas/gRNA4的切割率為49.7%。2.CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 細胞中 E6、E7 表達抑制,相應(yīng)的 p53、pRb 蛋白上調(diào):經(jīng) Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染48小時后的C33A和C33A/LV-HPV58 E6E7細胞。Western-Blot檢測細胞中E6、E7、p53和pRb蛋白的表達結(jié)果顯示Cas/gRNA1、Cas/gRNA2可抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞E6基因表達,對E7基因表達不影響,相應(yīng)的引起p53蛋白的增加;Cas/gRNA3、Cas/gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞E7基因表達,對E6基因表達不影響,相應(yīng)的引起pRb蛋白的增加。3.CRISPR-Cas9系統(tǒng)抑制C33A/LV-HPV58E6E7腫瘤細胞增殖生長:對轉(zhuǎn)染了Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4 的 C33A/LV-HPV58E6E7細胞以及C33A/HPV58和C33A細胞進行CCK-8細胞增殖實驗檢測。結(jié)果顯示,CRISPR-Cas9系統(tǒng)分別有效地減緩C33A/HPV58+gRNA1、C33A/HPV58+gRNA2、C33A/HPV58+gRNA3 和 C33A/HPV58+gRNA4 的細胞OD值增長,即CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞的增殖活力,并從監(jiān)測第一天開始可以一直維持到第5天。而僅僅轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒載體的C33A細胞的增殖速率卻不受CRISPR-Cas9系統(tǒng)的影響。同時,結(jié)果也表明HPV58對C33A腫瘤細胞的生長起促進作用。4.CRISPR-Cas9系統(tǒng)促進C33A/LV-HPV58E6E7腫瘤細胞凋亡:分別用Cas9/gRNA1、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 處理 C33A/LV-HPV58 E6E7腫瘤細胞和C33A腫瘤細胞。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示C33A/LV-HPV58E6E7細胞在Cas9/gRNA處理后均顯示凋亡率急劇增加。Cas9gRNAl、Cas9gRNA2 導(dǎo)致 C33A/LV-HPV58E6E7 細胞凋亡率達 60%,Cas9gRNA3、Cas9gRNA4 導(dǎo)致 C33A/LV-HPV58E6E7 細胞凋亡率達 40-50%。而 Cas9/gRNA處理后對C33A細胞的細胞凋亡率與空白組基本一致,沒有明顯的變化。研究結(jié)論:1.雙gRNA法構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng),可以對HPV58腫瘤細胞基因組精確及有效地進行切割,是一種高效便捷的基因敲除技術(shù)。2.CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 細胞中 E6、E7 表達抑制,p53、pRb蛋白上調(diào),并抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞的增殖活力,促進C33A/LV-HPV58E6E7細胞凋亡。CR1SPR-Cas9系統(tǒng)未來可以被開發(fā)成為輔助治療HPV58感染及相關(guān)宮頸癌的一種基因治療技術(shù)。第二部分:PBAE和Micelle與CRISPR-Cas9質(zhì)粒合成納米藥物用于治療HPV58相關(guān)宮頸癌的實驗研究研究目的:驗證基于聚β-氨基酯(Polybeta amino ester,PBAE)納米顆粒和F127/PPO-NMe3/pCas9納米膠束(Micelle)與CRISPR-Cas9質(zhì)粒合成的新型納米藥物,能否成為治療HPV58感染及相關(guān)宮頸癌的一種新型小分子靶向基因藥物。研究方法:1.分別合成PBAE及納米顆粒和制備Micelle納米膠束,對其表征進行鑒定。2.將PBAE納米顆粒及Micelle納米膠束分別與CRISPR-Cas9系統(tǒng)的表達質(zhì)粒合成納米藥物。將納米藥物分別作用HPV58陽性新鮮宮頸癌組織及C33A/LV-HPV58E6E7 細胞系。3.利用Western-Blot檢測HPV58陽性宮頸癌組織中E6、E7、p53、pRb蛋白的表達變化,利用CCK-8增殖實驗檢測對C33A/LV-HPV58E6E7細胞系增殖影響。研究結(jié)果:1.新型納米藥物作用C33A/LV-HPV58E6E7細胞系后,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞生長:使用PBAE和Micelle制成的納米顆粒分別與 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能質(zhì)粒結(jié)合并分別作用C33A/LV-HPV58E6E7細胞系后,CCK-8細胞增殖實驗檢測顯示C33A/LV-HPV58E6E7細胞的增殖活力均受到明顯抑制,這種趨勢從監(jiān)測第1天就已經(jīng)比較明顯并可以一直維持到第5天。而C33A細胞的增殖速率卻不受CRISPR-Cas9系統(tǒng)的影響。2.新型納米藥物作用于HPV58陽性宮頸癌組織,可抑制細胞中E6、E7表達,相應(yīng)的p53、pRb蛋白上調(diào):使用PBAE和Micelle制成的納米顆粒分別與 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能質(zhì)粒結(jié)合并作用上述兩例HPV58陽性宮頸癌組織,Western Blot檢測顯示gRNA1、gRNA2可抑制細胞E6基因表達,相應(yīng)的引起p53蛋白的增加;gRNA3、gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞E7基因表達,相應(yīng)的引起pRb蛋白的增加。研究結(jié)論:使用PBAE納米顆粒和Micelle納米膠束做為藥物載體,可輸送CRISPR-Cas9質(zhì)粒至細胞內(nèi),通過抑制HPV58陽性宮頸癌細胞中E6、E7表達,上調(diào)p53、pRb蛋白,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7細胞的增殖活力,有望成為治療HPV58感染及相關(guān)宮頸癌的新型小分子靶向基因藥物。
【圖文】：

山東大學(xué)博士學(xué)位論文逡逑理如圖１所示：在ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ基因座上游會表達反式激活ＲＮＡ邋（ｔｒａｎｓ－逡逑ａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ，邋ｔｒａｃｒＲＮＡ）邋；邋ｔｒａｃｒＲＮＡ邋會參與邋ＣＲＪＳＰＲ邋相關(guān)的邋ＲＮＡＣＣＲＩＳＰＲ－逡逑ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡ，ｃｒＲＮＡ）的加工；Ｃａｓ９是一種內(nèi)切酶，其具有ＲｕｖＣ和ＨＮＨ兩逡逑個內(nèi)切酶活性中心。ｔｒａｃｒＲＮＡ５’端的序列和ｃｒＲＮＡ３’端的保守序列通過堿基互逡逑補配對形成個雜交分子，，這個雜交分子通過其特殊的空間結(jié)構(gòu)和Ｃａｓ９蛋Ａ相互逡逑結(jié)合形成一個蛋白－ＲＮＡ復(fù)合物，該復(fù)合物引導(dǎo)Ｃａｓ９蛋白在與ｃｒＲＮＡ配對的序逡逑列靶位點通過其兩個內(nèi)切酶活性中心分別切斷雙鏈ＤＮＡ，其中ＨＮＨ切斷與逡逑ｃｒＲＮＡ互補的一條鏈，ＲｕｖＣ切斷非互補鏈，從而造成雙鏈ＤＮＡ斷裂（ＤＮＡ逡逑ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ邋ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）邋［３３］。利用邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９邋系統(tǒng)的特性，可用于基因敲逡逑除、基因修復(fù)、基因調(diào)控、文庫篩選及基因型鑒定等［３３＿３７］。已有研究報道

圖２．邋ｐＡＩＯ＿ｍＣｈｅｒｒｙ酶切位點圖逡逑Ｆｉｇ．２邋ｐＡＩＯ＿ｍＣｈｅｎ＊ｙ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｃｕｔｔｉｎｇ邋ｓｉｔｅ邋ｍａｐ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33


本文編號：2619635