【摘要】：研究背景:卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅全球女性生命健康的常見惡性腫瘤,目前卵巢癌的主要治療方法包括外科手術(shù)治療和以鉑藥為核心的化學(xué)藥物治療,而長期應(yīng)用化療藥物引起的耐藥嚴(yán)重限制了其治療效果。因此,迫切需要研究卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥機(jī)制,尋找提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的有效方法。已有研究發(fā)現(xiàn),順鉑可以通過靶向損傷腫瘤細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生細(xì)胞殺傷作用。但當(dāng)應(yīng)用順鉑時(shí),腫瘤細(xì)胞將產(chǎn)生一系列線粒體質(zhì)量控制來抵抗順鉑的細(xì)胞毒性。最近,越來越多的證據(jù)表明,Bcl-2家族與線粒體功能調(diào)控密切相關(guān),其參與調(diào)控線粒體自噬、細(xì)胞凋亡以及線粒體分裂與融合的動(dòng)態(tài)過程,是線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵因子。在細(xì)胞凋亡過程中,通過抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白介導(dǎo)的線粒體融合,Bcl-2家族促凋亡蛋白BAX和BAK過表達(dá)可促進(jìn)線粒體分裂。然而,Bcl-2家族蛋白質(zhì)如何在分子水平上影響線粒體動(dòng)力學(xué)的機(jī)制尚不明確。Bcl-2家族蛋白可通過許多通路調(diào)控線粒體質(zhì)量,其中包括參與調(diào)節(jié)線粒體功能的SIRT3蛋白通路。SIRT3是NAD~+依賴性組蛋白去乙�；讣易宓某蓡T之一,近年來因其在腫瘤遺傳學(xué)、衰老、神經(jīng)退行性疾病中的作用備受關(guān)注,在生理狀態(tài)下SIRT3定位于細(xì)胞核與線粒體,當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)或當(dāng)SIRT3表達(dá)增加時(shí),SIRT3會(huì)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至線粒體。并且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,SIRT3在沉默Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中不可或缺,換言之SIRT3是Bcl-2調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)。鑒于SIRT3和Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,我們嘗試探討SIRT3是否參與調(diào)節(jié)與Bcl-2家族蛋白功能相關(guān)的線粒體功能障礙。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?卵巢癌預(yù)后不良主要是由化療耐藥引起的。越來越多的研究表明,Bcl-2家族蛋白與腫瘤及線粒體動(dòng)力學(xué)的分裂/融合調(diào)控之間存在一定關(guān)系,且參與腫瘤的耐藥機(jī)制。然而,Bcl-2家組蛋白通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的線粒體功能增加對(duì)順鉑敏感性的具體機(jī)制仍不清楚。SIRT3作為組蛋白脫乙酰酶,參與腫瘤中線粒體功能的調(diào)節(jié),沉默而Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)的凋亡需要SIRT3的參與。在本研究中,我們旨在探討SIRT3與ABT737和順鉑在卵巢癌細(xì)胞中誘導(dǎo)的線粒體功能障礙之間的機(jī)制聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)方法:Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。使用SIRT3脫乙酰酶熒光測定法評(píng)估SIRT3活性。在JC-1染色后通過流式細(xì)胞術(shù)檢查線粒體膜電位。通過蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)SIRT3的過表達(dá)和敲低以及細(xì)胞凋亡。通過免疫熒光染色或蛋白質(zhì)印跡分析檢測線粒體裂變/融合動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:確定了Bcl-2抑制劑ABT737可以通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平,導(dǎo)致線粒體膜電勢去極化,最終導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡;SIRT3的過度激活通過線粒體途徑促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡,特異性敲減SIRT3可部分逆轉(zhuǎn)順鉑聯(lián)合ABT737對(duì)線粒體膜電勢的影響,SIRT3是ABT737增強(qiáng)SKOV3卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的關(guān)鍵分子,并且SIRT3的表達(dá)量與活性均對(duì)該過程有影響;順鉑聯(lián)合ABT737對(duì)線粒體融合無明顯作用,ABT737聯(lián)合順鉑促進(jìn)了DRP1從胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體,從而導(dǎo)致線粒體的分裂。SIRT3的激活增加了線粒體中DRP1的定位,而胞漿中DRP1的定位減少了,提示SIRT3的激活使DRP1由胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體,進(jìn)而可能促進(jìn)線粒體的分裂。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:應(yīng)用Bcl-2的小分子抑制劑ABT737聯(lián)合順鉑,SIRT3的表達(dá)上調(diào)并且活性升高,可能促進(jìn)了SKOV3卵巢癌細(xì)胞的線粒體分裂,最終導(dǎo)致線粒體途徑凋亡,從而提高其對(duì)順鉑的敏感性,為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥提供新的方法和思路。
【圖文】：

圖 1.1 卵巢癌的分類及治療現(xiàn)狀B 細(xì)胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白是調(diào)控凋亡過程的主要因其可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[17-19]，如圖 1.2。與正常細(xì)胞相比，Bcl-2 家族在許多腫瘤中均呈高表達(dá)[20]。此外，Bcl-2 家族抗凋亡成員如 Bcl-2、Mcl-1、Bcl-x過表達(dá)可增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[11]。因此，Bcl-2 被認(rèn)為是癌癥治療的靶研究顯示，采用小分子抑制劑可干擾 Bcl-2 和促凋亡組分之間的相互作用，從而起腫瘤的干擾與抑制[21]。通過核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）篩選，ABT737 是一種強(qiáng)效的抗凋亡蛋白抑制劑，主要抑制 Bcl-2，Bcl-xL 和 Bcl-w，具同細(xì)胞毒性，并在各種癌癥類型中誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡，包括卵巢癌，膽管癌和肺癌相關(guān)機(jī)制研究表明，ABT737 是通過調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)實(shí)現(xiàn)其功能，而不是直接啟動(dòng)凋程[23]。

圖 1.2 Bcl-2 家族蛋白分類近年來，越來越多的證據(jù)表明 Bcl-2 家族蛋白與癌癥及線粒體動(dòng)力學(xué)的分裂/融合調(diào)控之間存在一定聯(lián)系[24,25]。Bcl-2 家族的促凋亡成員通過抑制 Bcl-2 等抗凋亡蛋白介導(dǎo)的線粒體融合，促進(jìn)線粒體的分裂[26]。此外，其他研究表明，BAX 和 BAK 蛋白的過表達(dá)也可誘導(dǎo)線粒體分裂[27]。綜上所述，這些結(jié)果顯示 Bcl-2 家族在線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控中發(fā)揮作用。然而，，Bcl-2 家族蛋白影響線粒體動(dòng)力學(xué)的具體分子機(jī)制尚不清楚。SIRT3 是 SIRTuin 家族的一員，在哺乳動(dòng)物中主要分布于線粒體，作為一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的組蛋白去乙�；�，其參與活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）的清除和線粒體正常功能的調(diào)節(jié)[28,29]。據(jù)報(bào)道，山奈酚（Kaempferol）可通過降低 Bcl-2 和增加 SIRT3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，可以觀察到 SIRT3 定位于線粒體，提示 SIRT3 在線粒體凋亡通路中發(fā)揮作用[30]。最近的研究指出，沉默 Bcl-2 誘導(dǎo)的凋亡需要 SIRT3 的參與，這意味著 SIRT3 可能是 Bcl-2 調(diào)控凋亡過程中必不可少的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2619595