【摘要】：背景與目的卵巢癌是三大女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。卵巢癌發(fā)病隱匿,早期無(wú)明顯的臨床癥狀,大約75%的患者就診時(shí)己屬晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)。漿液性卵巢癌是卵巢惡性腫瘤中最常見的亞型,生長(zhǎng)速度快,易早期發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移,治療后易產(chǎn)生化療耐藥。卵巢癌患者經(jīng)過(guò)系統(tǒng)全面的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類、紫杉醇聯(lián)合化療,達(dá)到完全緩解或部分緩解后,仍時(shí)時(shí)面臨復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的危險(xiǎn),其5年存活率僅在30%左右。卵巢癌預(yù)后差的根本原因在于缺乏有效的早期診斷手段和預(yù)后檢測(cè)指標(biāo),且卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確。預(yù)測(cè)卵巢癌臨床預(yù)后,尋找卵巢癌早期篩查的特異性標(biāo)志物和新的卵巢癌治療靶點(diǎn)是目前卵巢癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn),將有利于卵巢癌的早期診斷和臨床治療,從而改善預(yù)后,降低病死率。根據(jù)癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò),對(duì)HGSOC進(jìn)行分子分型,可分為四種亞型:免疫反應(yīng)性,增殖性,分化性和間質(zhì)性。免疫反應(yīng)性亞型主要包括T細(xì)胞趨化因子配體和受體,如CXCL11,CXCL10和CXCR3。增殖性亞型的主要代表性分子為HMGA2,SOX11,MCM2,PCNA。分化性亞型主要包括MUC1,MUC16,SLPI。間質(zhì)性亞型主要有HOX,FAP,ANGPTL2,ANGPTL1。通過(guò)基因表達(dá)譜分析卵巢癌的分子分型與臨床和病理特征有關(guān)。在臨床上,大多數(shù)患者屬于免疫反應(yīng)性,增殖性和分化性等亞型,間質(zhì)性亞型患者偏少。文獻(xiàn)研究顯示不同的亞型預(yù)后不同,本課題組期待利用多種亞型相結(jié)合,以大量HGSOC患者的組織芯片(TMA)為載體,通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法,旨在構(gòu)建合適的數(shù)學(xué)模型,對(duì)卵巢癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,指導(dǎo)臨床治療。本課題組通過(guò)分子分型研究,發(fā)現(xiàn)不同亞型的卵巢癌其預(yù)后有所不同,增殖亞型在預(yù)后中發(fā)揮的作用尤其顯著。PCNA作為卵巢癌增殖亞型的重要代表性分子,可與P15pPA(即KIAA0101)的保守的PCNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合。同時(shí),課題組利用基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)和蛋白質(zhì)質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,發(fā)現(xiàn)KIAA0101在漿液性卵巢癌中的表達(dá)高于正常輸卵管傘中的表達(dá),并且KIAA0101在漿液性卵巢癌中的表達(dá)與預(yù)后相關(guān),即KIAA0101高表達(dá)患者預(yù)后差,低表達(dá)患者預(yù)后好。KIAA0101主要參與DNA修復(fù)損傷,細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程等。文獻(xiàn)報(bào)道KIAA0101在胃癌,食管癌,乳腺癌,腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌中發(fā)揮癌基因的作用,并且KIAA0101過(guò)表達(dá)具有預(yù)后意義。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果和既往文獻(xiàn)研究,我們猜想,KIAA0101可能在漿液性卵巢癌中發(fā)揮癌基因的作用,且與患者預(yù)后相關(guān)。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT/mTOR通路是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑。該信號(hào)通路參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬等重要生理過(guò)程。其異�；罨c細(xì)胞轉(zhuǎn)化,腫瘤發(fā)生,腫瘤進(jìn)展和化療耐藥有關(guān)。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是包括卵巢癌在內(nèi)的許多人類惡性腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)途徑中失控最嚴(yán)重的信號(hào)通路之一。PI3K/AKT/mTOR通路在卵巢癌中經(jīng)常被激活,在卵巢癌的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,且與卵巢癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。本課題主要探討卵巢癌分子分型與預(yù)后的關(guān)系,研究亞型標(biāo)志物對(duì)預(yù)后的影響,將不同亞型的標(biāo)志物結(jié)合,構(gòu)建數(shù)學(xué)模型,預(yù)測(cè)預(yù)后,指導(dǎo)臨床治療。選取增殖亞型代表性分子PCNA的結(jié)合分子一KIAA0101,詳細(xì)研究其在卵巢癌中的調(diào)控作用機(jī)制。本課題研究主要從以下3個(gè)部分進(jìn)行闡述:第一部分:卵巢癌分子分型的預(yù)后研究第二部分:KIAA0101促進(jìn)漿液性卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移及分子機(jī)制研究第三部分:KIAA0101促進(jìn)漿液性卵巢癌化療耐藥及分子機(jī)制研究第一部分:卵巢癌分子分型的預(yù)后研究背景和目的:上皮性卵巢癌是婦科惡性腫瘤中致死率最高的癌癥,很大程度上歸因于大多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期。近70%的上皮性卵巢癌為HGSOC。目前缺乏卵巢癌早期診斷的有效篩查方法。目前尚沒(méi)有可以精確預(yù)測(cè)HGSOC臨床結(jié)局的特異性標(biāo)志物。根據(jù)癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò),對(duì)HGSOC進(jìn)行分子分型,可分為如下4種亞型:免疫反應(yīng)性,增殖性,分化性和間質(zhì)性。CXCL11為免疫反應(yīng)亞型的代表,CXCL11可以與CXCR3受體結(jié)合。CXCL11高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌,結(jié)直腸癌,腎細(xì)胞癌,胃腺癌等不良預(yù)后相關(guān),目前CXCL11在HGSOC中尚無(wú)研究。HMGA2是增殖亞型的代表。HMGA2是高遷移率A組蛋白質(zhì)家族的成員,是一種原癌基因,參與細(xì)胞生長(zhǎng),分化,凋亡和腫瘤發(fā)生。HMGA2在多種人類腫瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用。MUC16屬于分化亞型的代表,CA125是MUC16蛋白的重復(fù)肽表位,是監(jiān)測(cè)卵巢癌的重要生物標(biāo)志物。MUC16可能促進(jìn)上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。MUC16表達(dá)與卵巢癌預(yù)后之間的關(guān)系存在爭(zhēng)議。本研究利用組織芯片(TMA),對(duì)HGSOC的分子分型進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析,判斷各亞型在HGSOC中的預(yù)后效果;通過(guò)亞型之間的聯(lián)系,聯(lián)合分析多個(gè)蛋白的免疫組化結(jié)果,建立一種可用于評(píng)估HGSOC臨床結(jié)局的蛋白模型。材料和方法:利用本課題組制作的3個(gè)TMA,對(duì)CXCL11,HMGA2,MUC16進(jìn)行免疫組化染色,根據(jù)染色情況,劃分為低表達(dá)組和高表達(dá)組,匯總HGSOC患者的臨床信息,分析CXCL11,HMGA2,MUC16表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系。利用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析來(lái)評(píng)估生物標(biāo)志物表達(dá)與臨床結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù)CXCL11,HMGA2,MUC16的免疫組化和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián),將3個(gè)指標(biāo)相互聯(lián)合,設(shè)計(jì)一種可用于預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性高的蛋白模型。結(jié)果:1.HGSOC不同分子分型的免疫組織化學(xué)染色3種分型代表性分子的免疫組化染色結(jié)果分四種不同強(qiáng)度的染色:無(wú)染色,弱染色,中等染色和強(qiáng)染色,其中無(wú)染色和弱染色為分子低表達(dá),中等染色和強(qiáng)染色為分子高表達(dá)。CXCL11和MUC16表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)著色,HMGA2主要表現(xiàn)為細(xì)胞核著色。2.3個(gè)標(biāo)記物對(duì)HGSOC預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值CXCL11在HGSOC中的表達(dá)顯著高于其在輸卵管傘中的表達(dá)。CXCL11高表達(dá)組總生存時(shí)間短,低表達(dá)組總生存時(shí)間長(zhǎng)。HMGA2在HGSOC中的表達(dá)顯著高于輸卵管傘。HMGA2高表達(dá)組總生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間明顯低于HMGA2低表達(dá)組。MUC16表達(dá)與預(yù)后無(wú)關(guān)。3.推導(dǎo)基于臨床預(yù)后結(jié)局的雙蛋白模型根據(jù)免疫組化結(jié)果,將CXCL11和HMGA2聯(lián)合,建立雙蛋白模型,用于預(yù)測(cè)HGSOC的預(yù)后。結(jié)果顯示該雙蛋白分子模型是HGSOC的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。4.雙蛋白預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)效能為了檢測(cè)雙蛋白預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)效能,課題組比較了 CXCL11,HMGA2和雙蛋白模型對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)的敏感度,特異度和曲線下面積(AUC)。雙蛋白模型預(yù)后預(yù)測(cè)的敏感度和特異度分別為75.00%和64.50%(P = 0.002),AUC為0.694,CXCL11與HMGA2雙蛋白模型對(duì)HGSOC預(yù)后具有較大的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)論:1.CXCL11在HGSOC中高表達(dá),且與預(yù)后相關(guān);HMGA2在HGSOC中高表達(dá),且與預(yù)后相關(guān);MUC16與HGSOC預(yù)后無(wú)關(guān)。2.CXCL11和HMGA2雙蛋白模型是HGSOC不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。3.CXCL11和HMGA2雙蛋白模型有望用于臨床,判斷HGSOC預(yù)后,指導(dǎo)臨床治療。第二部分:KIAA0101促進(jìn)漿液性卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移及分子機(jī)制研究背景和目的:卵巢癌是危害全世界女性健康的婦科惡性腫瘤之一,病死率高,預(yù)后差,這與卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,侵襲能力強(qiáng)、易早期轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題研究的分子KIAA0101是與DNA損傷修復(fù),細(xì)胞增殖密切相關(guān)的分子。已有報(bào)道KIAA0101在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用,但其在漿液性卵巢癌中的作用及機(jī)制尚未明確。卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)約87%的漿液性卵巢癌病例存在FOXM1通路的異常激活,本課題組前期的表達(dá)譜芯片結(jié)果也顯示FOXM1在漿液性卵巢癌中高表達(dá)。FOXM1可以促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程。文獻(xiàn)研究證明FOXM1在漿液性卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。FOXM1為重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游一系列重要基因的表達(dá)。通過(guò)CHIP-seq聯(lián)合生物信息學(xué)分析,KIAA0101為FOXM1的下游靶基因,但FOXM1對(duì)KIAA0101具體的調(diào)控方式,調(diào)控位點(diǎn)尚不清楚。本研究主要通過(guò)對(duì)大量臨床標(biāo)本的KIAA0101的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),分析KIAA0101表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,在卵巢癌細(xì)胞系中敲低或過(guò)表達(dá)KIAAO101,研究卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力的變化。本研究還通過(guò)luciferase,rescue等探究FOXM1調(diào)控KIAA0101增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。材料和方法:分別收集漿液性卵巢癌組織(SOC)和良性疾病患者正常輸卵管傘組織(FT),使用RT-qPCR、western blot檢測(cè)SOC和FT中KIAA0101的表達(dá)。利用本實(shí)驗(yàn)室制作的3個(gè)組織芯片(TMA),進(jìn)行KIAA0101免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)KIAA0101在FT和SOC中的表達(dá)及KIAA0101表達(dá)與SOC預(yù)后的關(guān)系。選擇多個(gè)卵巢癌細(xì)胞系(A2780,H08910,SKOV3),構(gòu)建KIAA0101的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒,利用慢病毒包裝系統(tǒng)感染卵巢癌細(xì)胞系,使其低表達(dá)或者過(guò)表達(dá)KIAA0101基因,篩建出穩(wěn)定細(xì)胞系。利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)速度,利用平板克隆技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系的克隆形成能力,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。利用western blot對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定。利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞創(chuàng)傷后的愈合能力,利用transwell小室檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力,探究KIAA0101對(duì)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。利用westemblot對(duì)EMT相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定。利用免疫熒光技術(shù),對(duì)FOXM1和KIAA0101的細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行研究,觀察兩者在細(xì)胞內(nèi)的位置。利用免疫組化的方法,對(duì)TMA患者依次進(jìn)行FOXM1和KIAA0101免疫組化染色,根據(jù)免疫組化結(jié)果,進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn),分析兩者的表達(dá)相關(guān)性。利用KMplotter分析FOXM1在大樣本卵巢癌中的預(yù)后情況。使用FOXM1的小干擾RNA下調(diào)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780,H08910和SKOV3中的FOXM1,提RNA和蛋白,進(jìn)行RT-qPCR和w評(píng)6816blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)FOXM1下調(diào)后KIAA0101表達(dá)變化情況。利用生物信息學(xué)手段,分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中FOXM1和KIAA0101的mRNA的相關(guān)性,進(jìn)一步驗(yàn)證FOXM1對(duì)KIAA0101的調(diào)控。利用Ensembl查詢KIAA0101的啟動(dòng)子序列,利用Gene Regulation聯(lián)合文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測(cè)FOXM1對(duì)KIAA0101潛在的調(diào)控序列和位點(diǎn)。將KIAA0101的啟動(dòng)子擴(kuò)增并克隆到pGL4.26中以產(chǎn)生野生型(WT)啟動(dòng)子。對(duì)于突變型(MT)質(zhì)粒,使用重疊延伸PCR構(gòu)建。本研究構(gòu)建了三個(gè)經(jīng)典突變和一個(gè)非經(jīng)典突變(ACHR)。使用Dual-Glo熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)測(cè)量螢光素酶活性并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用挽救實(shí)驗(yàn),觀察FOXMI下調(diào)是否能恢復(fù)KIAA0101上調(diào)引起的表型變化,進(jìn)一步驗(yàn)證FOXM1對(duì)KIAA0101的調(diào)控。結(jié)果:1.KIAA0101在漿液性卵巢癌中表達(dá)高于正常對(duì)照組且與漿液性卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)KIAA0101在卵巢癌中高表達(dá):RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KIAA0101mRNA在漿液性卵巢癌中表達(dá)顯著高于正常對(duì)照中表達(dá)。Western blot和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KIAA0101蛋白在漿液性卵巢癌中表達(dá)均顯著高于在正常對(duì)照中表達(dá)。KIAA0101的表達(dá)與卵巢癌病人的預(yù)后相關(guān):根據(jù)免疫組化染色結(jié)果,將KIAA0101的表達(dá)分為兩組,高表達(dá)組和低表達(dá)組;KIAA0101高表達(dá)組預(yù)后較KIAA0101低表達(dá)組差;KIAA0101高表達(dá)組漿液性卵巢癌患者術(shù)后2年和5年生存時(shí)間均短于KIAA0101低表達(dá)組患者;KIAA0101的表達(dá)還與FIGO分期相關(guān)。2.KIAA0101增強(qiáng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的增殖能力卵巢癌細(xì)胞系高表達(dá)KIAA0101后,MTT檢測(cè)顯示生長(zhǎng)速度加快,平板克隆提示細(xì)胞系克隆形成能力增強(qiáng)。KIAA0101敲除后的卵巢癌細(xì)胞系中,細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,克隆形成能力降低。KIAA0101的表達(dá)可影響卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,利用腺苷對(duì)KIAA0101敲低的A2780細(xì)胞系進(jìn)行雙阻斷,使兩組細(xì)胞同步化,再進(jìn)行釋放,分別釋放Oh,2h,3h和6h,找到KIAA0101發(fā)揮作用的時(shí)相,結(jié)果顯示KIAA0101敲低會(huì)引起A2780細(xì)胞系G1/S期阻滯。細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的western blot結(jié)果提示:KIAA0101干擾后,CCNA2,CCNB1,CCND1,CCNE1表達(dá)下調(diào),P27和P21表達(dá)上調(diào);KIAA0101過(guò)表達(dá)后,結(jié)果相反。3.KIAA0101增強(qiáng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力KIAA0101過(guò)表達(dá)后,transwell小室顯示卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲速度加快;KIAA0101干擾后,transwell小室顯示卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低,且劃痕實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)傷愈合時(shí)間顯著延長(zhǎng)或者不愈合;western blot顯示KIAA0101調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生,具體表現(xiàn)為KIAA0101過(guò)表達(dá)后上皮性標(biāo)志物E-cad 下調(diào),間質(zhì)性標(biāo)志物 N-cad,ZEB1,MMP2,MMP9,Snail 等上調(diào);KIAA0101敲減后,上皮性標(biāo)志物升高,間質(zhì)性標(biāo)志物降低。4.FOXM1調(diào)控KIAAO101的表達(dá)免疫熒光共定位顯示FOXMI和KIAA010I均定位于細(xì)胞核中。對(duì)116例HGSOC患者的免疫組化分析結(jié)果顯示,FOXM1與KIAA0101表達(dá)具有一定的相關(guān)性。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析示FOXM1與KIAA0101在TCGA卵巢癌中的表具有相關(guān)性。用FOXM1小干擾RNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系H08910和SKOV3后,FOXMI的mRNA和蛋白水平顯著下降,同時(shí)KIAA0101的mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯降低。5.FOXM1轉(zhuǎn)錄激活KIAA0101的啟動(dòng)子從而調(diào)控其表達(dá)我們擴(kuò)增了 3段含有FOXM1潛在的結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子序列,依次為5'轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上方:544bp(-712/-169),519bp(-2244/-1726),496bp(-2700/-2205)連接到PGL4.26質(zhì)粒上。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示這3個(gè)區(qū)域中只有496bp(-2700/-2205)被FOXM1激活。利用重疊PCR對(duì)496bp(-2700/-2205)的4個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示只有-2370bp位點(diǎn)突變后熒光素活性顯著降低,即-2370bp是FOXM1轉(zhuǎn)錄激活KIAA0101的結(jié)合位點(diǎn)。6.FOXM1下調(diào)可以挽救KIAA0101過(guò)表達(dá)在漿液性卵巢癌中的促進(jìn)作用在KIAA0101過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系中,瞬轉(zhuǎn)FOXM1的小干擾RNA,平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示KIAA0101上調(diào)引起的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)的表型可以被FOXMI的小干擾所消除;transwell小室顯示FOX]M1干擾可以挽救KIAA0101過(guò)表達(dá)引起的卵巢癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)能力的改變。相反,KIAA0101小干擾RNA可以消除部分FOXM1過(guò)表達(dá)引起的卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)能力的變化。結(jié)論:1.KIAA0101在漿液性卵巢癌的表達(dá)顯著高于正常輸卵管傘的表達(dá),且其高表達(dá)提示預(yù)后差。2.KIAA0101促進(jìn)漿液性卵巢癌的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力。3.FOXM1通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控KIAA0101從而促進(jìn)其增殖和轉(zhuǎn)移能力。第三部分:KIAA0101促進(jìn)漿液性卵巢癌化療耐藥及分子機(jī)制研究背景和目的:腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合順鉑、紫杉醇化療是卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,但過(guò)去的幾十年,卵巢癌患者的5年存活率一直徘徊在30%左右,主要由于卵巢癌細(xì)胞易產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性化療耐藥,病情緩解后易復(fù)發(fā)。文獻(xiàn)報(bào)道KIAA0101與肝癌的阿霉素耐藥和食管癌的順鉑耐藥相關(guān),目前尚不明確KIAA0101在漿液性卵巢癌化療耐藥中是否發(fā)揮作用。PI3K/AKT/mTOR通路在卵巢癌中通常存在異常激活,具體機(jī)制未明。自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的代謝途徑,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系,目前KIAA0101與細(xì)胞自噬方面的研究較少。本研究深入探討KIAA0101對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路及細(xì)胞自噬的影響。此外,本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)己有的大規(guī)模數(shù)據(jù)進(jìn)行共表達(dá)分析,構(gòu)建KIAA0101調(diào)控的下游分子網(wǎng)絡(luò)。KIAA0101的化療耐藥及分子機(jī)制研究為KIAA0101在漿液性卵巢癌中的作用提供重要的參考價(jià)值。材料和方法:對(duì)卵巢癌細(xì)胞施加一定濃度梯度的順鉑刺激,利用western blot觀察KIAA0101的表達(dá)是否隨著加藥濃度的改變而發(fā)生相應(yīng)變化。給細(xì)胞順鉑刺激后,觀察KIAA0101敲除后卵巢癌細(xì)胞形態(tài)的變化。利用MTT檢測(cè)KIAA0101干擾或者過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑化療的影響。利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KIAA0101干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑刺激的影響。檢測(cè)KIAA0101是否調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路。觀察KIAA0101是否影響卵巢癌細(xì)胞的自噬和凋亡。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)順鉑加藥后卵巢癌細(xì)胞凋亡率的改變,利用激光共聚焦顯微鏡觀察KIAA0101對(duì)卵巢癌細(xì)胞系自噬能力的影響。此外,利用western blot對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,凋亡方面,分析PARP,Cleaved PARP,Caspase 9,Cleaved caspase9,Caspase7,Cleaved caspase7,Bax 和 Bc12 等的變化趨勢(shì);自噬方面,分析 Atg16L1,Atgl2,Atg7,Atg5,Beclinl,P62,LC3 等的改變。最后,利用共表達(dá)分析,尋找KIAA0101可能調(diào)控的下游分子,并利用western blot進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果:1.KIAA0101增強(qiáng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥能力對(duì)A2780,HO8910,SKOV3細(xì)胞施加順鉑刺激后,western blot顯示隨著加藥濃度的增加,KIAA0101表達(dá)升高。加藥MTT發(fā)現(xiàn),KIAA0101過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系對(duì)順鉑更加耐受,其半數(shù)致死量(IC50)顯著高于正常對(duì)照細(xì)胞,KIAA0101敲低后,結(jié)果相反。給細(xì)胞施加順鉑刺激后,觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,結(jié)果顯示KIAA0101干擾后的細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感,趨向于凋亡。耐藥平板克隆顯示,KIAA0101敲低后,給予梯度濃度的順鉑刺激,隨著順鉑濃度的增加,其克隆形成能力顯著下降。2.KIAA0101 激活 PI3K/AKT/mTOR 通路KIAA0101過(guò)表達(dá)后,western blot顯示磷酸化的PI3K,AKT,mTOR均上調(diào),KIAA0101干擾后,磷酸化的PI3K,AKT,mTOR均下調(diào)。該通路激活后抑制細(xì)胞凋亡和自噬,促進(jìn)卵巢癌化療耐藥。3.KIAA0101抑制順鉑介導(dǎo)的漿液性卵巢癌細(xì)胞的凋亡KIAA0101 過(guò)表達(dá)后,western blot 結(jié)果顯不 CleavedPARP,Cleaved caspase 9,Cleaved caspase7,Bax降低,Bcl2升高,細(xì)胞凋亡顯著抑制,KIAA0101敲除后,促凋亡蛋白Bax升高,抗凋亡蛋白Bcl-2降低,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved PARP,Cleaved caspase 9,Cleavedcaspase7均升高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)順鉑加藥的HO8910細(xì)胞凋亡率,敲除KIAA0101的HO8910細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。4.KIAA0101抑制漿液性卵巢癌細(xì)胞的自噬利用免疫熒光探究KIAA0101對(duì)自噬的影響,KIAA0101敲除后,激光共聚焦顯微鏡顯示自噬小體增加,卵巢癌細(xì)胞自噬增強(qiáng)。自噬相關(guān)蛋白的western blot結(jié)果顯示,KIAA0101過(guò)表達(dá)后,自噬相關(guān)蛋白Atgl6L1,Atgl2,Atg7,Atg5,Beclinl,LC3表達(dá)下調(diào),P62表達(dá)上調(diào),即KIAA0101過(guò)表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的自噬,KIAA0101敲除促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的自噬。5.KIAA0101可以調(diào)控下游一系列重要分子的表達(dá)利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA和Oncomine進(jìn)行共表達(dá)分析,挑選其中相關(guān)系數(shù)高的 9 個(gè)重要分子:KIF23,PCNA,PRC1,CDC25C,UBE2C,TOP2A,Rad51,KIF20A和Aurora A。在干卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和HO8910中,分別干擾和過(guò)表達(dá)KIAA0101,利用western blot進(jìn)行驗(yàn)證,尋找KIAA0101調(diào)控的下游分子網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論:1.KIAA0101激活PI3K/AKT/mTOR通路,抑制順鉑介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬,促進(jìn)順鉑化療耐藥。2.KIAA0101調(diào)控一系列下游重要基因的表達(dá),如KIF23,PCNA,PRC1,CDC25C,UBE2C,TOP2A,Rad51,KIF20A 和 Aurora A。
【圖文】：

圖２．邋ＣＸＣＬｌｌ，邋ＨＭＧＡ２，邋ＭＵＣ１６的預(yù)后－總生存期分析逡逑（Ａ）邋ＣＸＣＬ１１總生存時(shí)間的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ圖，ＣＸＣＬ１１高表達(dá)提示ＨＧＳＯＣ不逡逑良預(yù)后，，主要表現(xiàn)為總生存時(shí)間縮短。（Ｂ）邋ＨＭＧＡ２總生存時(shí)間的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ逡逑圖，ＨＭＧＡ２高表達(dá)的ＨＧＳＯＣ患者總生存時(shí)間較低表達(dá)患者短。（Ｃ）邋ＭＵＣ１６總逡逑生存時(shí)間的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ圖，ＭＵＣ１６表達(dá)高低與ＨＧＳＯＣ的總生存T間無(wú)明顯逡逑關(guān)系。逡逑

圖３．ＣＸＣＬ１１，邋ＨＭＧＡ２，邋ＭＵＣ１６的預(yù)后－無(wú)進(jìn)展生存期分析逡逑（Ａ）ＣＸＣＬｌｌ無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ圖，ＣＸＣＬ１１高表達(dá)提示ＨＧＳＯＣ逡逑無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間較短，但是差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（Ｂ）邋ＨＭＧＡ２無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間逡逑的Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ圖，ＨＭＧＡ２高表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展相關(guān)，ＨＭＧＡ２高表達(dá)的逡逑ＨＧＳＯＣ患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間較低表達(dá)患者短。（Ｃ）邋ＭＵＣ１６無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間的逡逑Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ圖，ＭＵＣ１６表達(dá)高低與ＨＧＳＯＣ的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間無(wú)明顯關(guān)系。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2619392