【摘要】：目的研究卵泡微環(huán)境中外泌體對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結局的的影響,明確卵泡微環(huán)境中外泌體的來源。方法選取200例就診于寧夏醫(yī)科大學生殖中心僅因輸卵管因素行IVF的卵巢功能正常的年輕不孕患者,根據(jù)患者的妊娠結局分為兩組,即妊娠組和未妊娠組。收集臨床、實驗室數(shù)據(jù),比較兩組之間的AMH、FSH、FSH/LH、AFC、MⅡ卵率、受精率和優(yōu)胚率,并收集兩組患者的卵泡液,通過ExoQuick試劑盒分離出外泌體,在透射電鏡和掃描電鏡下觀察其形態(tài),采用Nanosight LM 10(Malvern)檢測卵泡液中外泌體的濃度,利用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法檢測外泌體的蛋白濃度;采用Western blot檢測外泌體表面標志物CD9、CD63和CD81;通過PCR檢測外泌體GDF9、BMP15的表達,從而明確外泌體的來源。采用多變量偏相關分析及l(fā)ogistic回歸分析評估AMH、FSH、FSH/LH、AFC、獲卵數(shù)及外泌體濃度對優(yōu)胚率及妊娠結局的預測價值。結果病歷資料分析結果顯示,兩組研究對象的血清AMH、FSH、LH、FSH/LH、AFC水平在統(tǒng)計學意義上沒有差異(P0.05);妊娠組的MⅡ卵率、受精率和優(yōu)胚率高于未妊娠組(P0.05);在電鏡下觀察到兩組研究對象的外泌體呈圓形或橢圓形膜性囊泡結構;Nanosight LM 10(Malvern)檢測結果顯示:未妊娠組外泌體平均顆粒濃度為2.93±1.55×10~(10)顆粒/mL,妊娠組為4.09±2.11×10~(10)顆粒/mL。兩組患者卵泡液中外泌體顆粒濃度差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);BCA法顯示妊娠組外泌體樣本的蛋白表達強度高于未妊娠組(P0.05),Western blot結果顯示兩組患者的外泌體均表達其表面特異性標志物CD9、CD63和CD81,且含同濃度蛋白的情況下,妊娠組的外泌體CD9、CD63和CD81表達明顯高于未妊娠組。PCR表明兩組研究對象的外泌體均表達卵子的標志物GDF9、BMP15�；AFSH(r=0.17,P=0.017)及卵泡液中外泌體濃度(r=0.881,P=0.00)是影響優(yōu)胚率的獨立因素,基礎AFC(B=0.107 P=0.033)及卵泡液中外泌體的濃度(B=0.419 P=0.00)是影響妊娠結局的獨立因素。結論:卵泡液中外泌體濃度是影響妊娠結局的獨立因素;發(fā)育后期卵泡中的外泌體可能來源于卵細胞。
【圖文】：

寧夏醫(yī)科大學碩士學位論文 結果1.2. 電鏡觀察外泌體形態(tài)外泌體已經被證明存在于卵泡液中，為了使外泌體可視化，采用透射電鏡觀察卵泡液中外泌體的形態(tài)，結果顯示兩組卵泡液中的外泌體均呈脂質雙層膜包圍的直徑為30-100nm 的圓形或類圓形小體（圖 1A、B），可單個分布，也可聚集成群，，其內可見低電子密度物質。對照組 PBS 中沒有球形膜結構（圖 1C）。在相同的五個視野中計數(shù)外泌體并計算平均數(shù)，妊娠組外泌體數(shù)量為 20±1.58 個/視野，未妊娠組外泌體數(shù)量為15±1.43 個/視野，妊娠組高于未妊娠組（P＜0.05）。為了進一步觀察卵母細胞膜上的外泌體，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察卵母細胞的超微結構，結果顯示在卵母細胞膜上可以觀察到直徑 30-100nm 的球形膜結構（圖 1D-F）。

圖 2 卵泡液中外泌體的顆粒濃度1.3. BCA 蛋白定量通過 BCA 蛋白定量，得到妊娠組卵泡液中外泌體的蛋白濃度平均數(shù)為：3.43 ±0.58μg/μL，未妊娠組卵泡液外泌體的蛋白濃度平均數(shù)為 2.94 ± 0.46μg/μL，妊娠組的外泌體蛋白濃度高于未妊娠組（P＜0.01，圖 3A）。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.8

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