【摘要】：目的研究卵泡微環(huán)境中外泌體對(duì)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結(jié)局的的影響,明確卵泡微環(huán)境中外泌體的來(lái)源。方法選取200例就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)生殖中心僅因輸卵管因素行IVF的卵巢功能正常的年輕不孕患者,根據(jù)患者的妊娠結(jié)局分為兩組,即妊娠組和未妊娠組。收集臨床、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù),比較兩組之間的AMH、FSH、FSH/LH、AFC、MⅡ卵率、受精率和優(yōu)胚率,并收集兩組患者的卵泡液,通過(guò)ExoQuick試劑盒分離出外泌體,在透射電鏡和掃描電鏡下觀察其形態(tài),采用Nanosight LM 10(Malvern)檢測(cè)卵泡液中外泌體的濃度,利用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法檢測(cè)外泌體的蛋白濃度;采用Western blot檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物CD9、CD63和CD81;通過(guò)PCR檢測(cè)外泌體GDF9、BMP15的表達(dá),從而明確外泌體的來(lái)源。采用多變量偏相關(guān)分析及l(fā)ogistic回歸分析評(píng)估AMH、FSH、FSH/LH、AFC、獲卵數(shù)及外泌體濃度對(duì)優(yōu)胚率及妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果病歷資料分析結(jié)果顯示,兩組研究對(duì)象的血清AMH、FSH、LH、FSH/LH、AFC水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上沒有差異(P0.05);妊娠組的MⅡ卵率、受精率和優(yōu)胚率高于未妊娠組(P0.05);在電鏡下觀察到兩組研究對(duì)象的外泌體呈圓形或橢圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu);Nanosight LM 10(Malvern)檢測(cè)結(jié)果顯示:未妊娠組外泌體平均顆粒濃度為2.93±1.55×10~(10)顆粒/mL,妊娠組為4.09±2.11×10~(10)顆粒/mL。兩組患者卵泡液中外泌體顆粒濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BCA法顯示妊娠組外泌體樣本的蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于未妊娠組(P0.05),Western blot結(jié)果顯示兩組患者的外泌體均表達(dá)其表面特異性標(biāo)志物CD9、CD63和CD81,且含同濃度蛋白的情況下,妊娠組的外泌體CD9、CD63和CD81表達(dá)明顯高于未妊娠組。PCR表明兩組研究對(duì)象的外泌體均表達(dá)卵子的標(biāo)志物GDF9、BMP15�；A(chǔ)FSH(r=0.17,P=0.017)及卵泡液中外泌體濃度(r=0.881,P=0.00)是影響優(yōu)胚率的獨(dú)立因素,基礎(chǔ)AFC(B=0.107 P=0.033)及卵泡液中外泌體的濃度(B=0.419 P=0.00)是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素。結(jié)論:卵泡液中外泌體濃度是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素;發(fā)育后期卵泡中的外泌體可能來(lái)源于卵細(xì)胞。
【圖文】：

寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果1.2. 電鏡觀察外泌體形態(tài)外泌體已經(jīng)被證明存在于卵泡液中，為了使外泌體可視化，采用透射電鏡觀察卵泡液中外泌體的形態(tài)，結(jié)果顯示兩組卵泡液中的外泌體均呈脂質(zhì)雙層膜包圍的直徑為30-100nm 的圓形或類圓形小體（圖 1A、B），可單個(gè)分布，也可聚集成群，，其內(nèi)可見低電子密度物質(zhì)。對(duì)照組 PBS 中沒有球形膜結(jié)構(gòu)（圖 1C）。在相同的五個(gè)視野中計(jì)數(shù)外泌體并計(jì)算平均數(shù)，妊娠組外泌體數(shù)量為 20±1.58 個(gè)/視野，未妊娠組外泌體數(shù)量為15±1.43 個(gè)/視野，妊娠組高于未妊娠組（P＜0.05）。為了進(jìn)一步觀察卵母細(xì)胞膜上的外泌體，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在卵母細(xì)胞膜上可以觀察到直徑 30-100nm 的球形膜結(jié)構(gòu)（圖 1D-F）。

圖 2 卵泡液中外泌體的顆粒濃度1.3. BCA 蛋白定量通過(guò) BCA 蛋白定量，得到妊娠組卵泡液中外泌體的蛋白濃度平均數(shù)為：3.43 ±0.58μg/μL，未妊娠組卵泡液外泌體的蛋白濃度平均數(shù)為 2.94 ± 0.46μg/μL，妊娠組的外泌體蛋白濃度高于未妊娠組（P＜0.01，圖 3A）。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.8

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5 胡

本文編號(hào)：2619300